共培养体系中小鼠淋巴细胞RNA编辑酶的表达

                           作者：孔亚林，窦科峰，张洪涛，冯全新，张福琴，赵青川

【关键词】共培

    cnExpression of RNA editase of mouse lymphocytes in a coculture system

    【Abstract】 AIM: To study the expression of RNA editase of mouse lymphocytes under the effect of heterogeneous antigen in a coculture system of mouse spleen cells and human liver cancer cells and to observe the relation between RNA editase and the functional status of lymphocytes by the use of FK506. METHODS:  Spleen cells of 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 and 24 h in the coculture system were observed and the expression of RNA editase was detected by semiquantitative PCR and was contrasted with the mouse spleen cells in a singleculture system. The mouse model with the immune system restrained by FK506 was made, its spleen cells were cocultured with stimulated cells and then the effect of FK506 on RNA expression of editase was detected by semiquantitative PCR. RESULTS:  ① The lymphocyte survival rate within 24 h in each group reached 70%. ② The expression of RNA editase in the coculture group tended to show a pattern of declining, ascending and declining again, while that in the control group tended to decline constantly until 12 h and then remained at a comparatively low level. ③ FK506 had an obvious suppressive effect on the expression of RNA editase and this effect declined as the coculture time went on. CONCLUSION:  The expression of RNA editase becomes active when stimulated by heterogeneous antigen and the expression level is related with the functional status of spleen cells.

    【Keywords】 spleen cells；coculture；RNA editase；PCR；FK506; immunosuppressive agents

    【摘要】 目的：通过小鼠脾细胞与人肝细胞肝癌细胞共培养，了解在异种抗原刺激下小鼠淋巴细胞RNA编辑酶表达的变化；并且通过免疫抑制药FK506的应用，观察RNA编辑酶与淋巴细胞功能状态的联系. 方法：观察共培养1，2，4，6，8，10，12，16，20及24 h的小鼠脾细胞，用半定量PCR的方法检测RNA编辑酶表达的变化，并以相同时段单独培养的小鼠脾细胞RNA编辑酶的表达情况进行对照；制备免疫功能受FK506抑制的小鼠模型，取其脾细胞与刺激细胞进行相同时段的共培养，用半定量PCR的方法检测FK506对脾细胞RNA编辑酶的影响. 结果： ①各组淋巴细胞的活细胞率24h内都能达到70%；②共培养组RNA编辑酶的表达呈降低后升高、再降低的趋势，对照组呈一直降低、至12 h后维持在较低的水平；③FK506对RNA编辑酶的表达呈现明显的抑制，与共培养组和对照组相比，这种抑制随着共培养时间的延长而减弱. 结论： 脾细胞RNA编辑酶在异种抗原的刺激下表达活跃，其表达的高低与脾细胞的功能状态有关.

    【关键词】 脾细胞；共培养；RNA编辑酶；PCR；FK506;免疫抑制剂

    0引言

    RNA编辑是近年来发现的转录后修饰过程［1］，它通过RNA编辑酶（adenosine deaminase acting on RNA,ADAR）对前RNA特异位点修饰，使腺嘌呤核苷转为次黄嘌呤核苷（Adenosinetoinosine，AtoI）. 除了传统的蛋白翻译途径外，RNA编辑可产生蛋白的同功异构体，接受编辑后的RNA翻译产物可能会与基因组编码的基因产物有所不同，从而在蛋白质多样性的形成中发挥重要的作用. 哺乳类目前已经克隆到4种RNA编辑酶［2-3］，即ADAR1，ADAR2，ADAR3，ADATs，它们具有相似的催化结构域. 近年来对AtoI RNA编辑的研究多局限于中枢系统，而对ImRNA含量丰富的众多外周组织中的AtoI RNA编辑情况的研究进展较慢. 我们通过研究小鼠淋巴细胞在异种抗原细胞的刺激下和FK506的抑制下ADAR1的表达情况，了解ADAR1与淋巴细胞功能状态之间的关系.

    1材料和方法

    1.1材料人肝细胞肝癌细胞（HCC）由第四军医大学西京肝胆外科实验室保存，BALB/c小鼠30只购自第四军医大学实验动物中心，体质量22~25 g，雌雄不限；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司，反转录试剂盒和PCR试剂为Toyobo公司产品，细胞培养采用100 mL/L小牛血清DMEM溶液（Gibco公司产品）.

    1.2方法

    1.2.1刺激细胞的制备将HCC细胞复苏后培养并传代，调整细胞密度至1×108个/L，把细胞转移至24孔板中，每孔细胞数目大约为105个，培养24 h，使细胞贴壁.

    1.2.2淋巴细胞的分离将小鼠断头处死，无菌条件下取出脾组织，用DHanks液冲洗1次，含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，在器皿中磨碎后由不锈钢纱网过滤，将过滤得到的液体以1∶1的比例与淋巴细胞分离液混合，2000 r/min离心25 min后液体分为3层，取中间云雾状细胞层，DHanks液洗1遍，将细胞重悬于含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，计数后将细胞密度调整为1×109个/L.

    1.2.3免疫抑制小鼠淋巴细胞的制备将小鼠在清洁环境下饲养，按照1 mg/（kg・d）的药量，给小鼠灌服FK506，持续7 d，按照上述方法分离淋巴细胞，调整细胞密度至1×109个/L.

    1.2.4分组和共培养体系的建立实验设对照组、实验组和免疫抑制组，每组各10只小鼠. 取培养有HCC的24孔板，实验组是将淋巴细胞与刺激细胞按10∶1比例依次混合至A到J孔中，免疫抑制组是将免疫抑制小鼠淋巴细胞与刺激细胞按10∶1比例混合至a到j孔中，轻轻吹吸5min使两种细胞充分接触，对照组是把相同数目的正常淋巴细胞取10份，转移至空白的24孔板中培养，编号1到10. 将所有细胞在37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养，分别在1，2，4，6，8，10，12，16，20及24 h时每组随机取1孔，收集其中脾细胞,台盼蓝排斥实验活细胞率后，提取RNA做反转录. 实验重复3次，观察结果.

    1.2.5半定量PCR检测淋巴细胞ADAR1的表达用Trizol提取淋巴细胞总RNA，分光光度仪检测各组所得RNA的浓度，根据浓度取相同量RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR反应. 引物用oligo6软件设计，ADAR1上游引物：5′ GCAGAGCAGTTGGGTTTCG 3′;下游引物：5′ GACAGGGTAATGGCGGGAC 3′，产物长度579 bp. 内参基因GAPDH上游引物：5′ CATCACTGCCACCCAGAAGA 3′;下游引物：5′ TGAAGTCGCAGGAGACAACC 3′，产物长度320 bp. 扩增ADAR1循环参数： 94℃预变性5 min，94℃变性45 s，56℃退火55 s，72℃延伸90 s，共32个循环. 扩增GAPDH循环参数为：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，57℃退火40 s，72℃延伸1 min，进行30个循环. 反应结束后，各取10 μL产物在30 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用Alpha.image凝胶图像分析仪扫描，PCR产物量以光密度×面积表示，目的片段与内参的光密度之比作为目的片段的mRNA的相对含量.统计学处理：光密度比值用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，同一时间不同组间比较采用单因素方差分析，对不同处理组光密度比值随时间变化趋势采用重复测量方差分析，P<0.05表示有统计学意义.

    2结果

    2.1台盼蓝排斥实验各组不同时段小鼠淋巴细胞的活细胞率由表1可看出各处理组淋巴细胞的活细胞率24 h内均能达到71%以上.

    表1不同时段各组小鼠淋巴细胞的活细胞百分率（略）

    2.2各组不同时段小鼠淋巴细胞ADAR1的表达

    2.2.1对照组不同时段小鼠淋巴细胞ADAR1的表达目的片段的电泳结果见图1，经由扫描仪所得的光密度之比值见表2. 由图可见，离体小鼠淋巴细胞ADAR1的表达随时间逐渐降低，最后维持在一较低水平.

    2.2.2实验组不同时段小鼠淋巴细胞ADAR1的表达目的片段的电泳结果见图2，扫描仪测得的光密度值之比见表2. 由图可见，受到异种细胞HCC刺激

    表2不同时段各组目的基因表达产物光密度比值(略)

    的离体小鼠淋巴细胞ADAR1的表达开始降低，随后又出现上升，从而表现出一个明显的“双峰”现象.

    2.2.3免疫抑制组不同时段小鼠淋巴细胞ADAR1的表达目的片段的电泳结果见图3，由扫描仪所得的光密度比值见表2. 由图可见，FK506对小鼠淋巴细胞ADAR1的表达有抑制作用，将细胞体外培养后随着时间延长抑制作用逐渐减弱.

    2.2.4各组不同时段目的基因的表达产物光密度比值对照组小鼠淋巴细胞ADAR1的表达在开始2 h内维持在较高水平，随后开始降低，至16 h开始维持在较低水平；实验组小鼠淋巴细胞ADAR1由开始的高表达至1 h后开始下降，至8 h又出现上升，维持至10 h后开始下降；免疫抑制组小鼠淋巴细胞ADAR1在4 h后逐渐开始表达，在12 h至16 h间达到高峰，随后表达下降，至20 h维持在较低水平. 各处理组ADAR1表达变化趋势存在差异（P<0.05）；各处理组之间相同时间段ADAR1的表达存在差异，差异存在于对照组和实验组、对照组和免疫抑制组以及实验组和免疫抑制组之间(P<0.05,表2).

    3讨论

    AtoI RNA编辑最早发现于中枢神经系统［4］，ADAR1的底物有两个，即5羟色胺受体和谷氨酸受体基因，谷氨酸受体mRNA经过编辑后，使得钙离子通道的通透性发生改变. 若小鼠谷氨酸受体B的等位基因发生编辑缺失，将导致癫痫的过早发生或出生后死亡［5］，在人类则可导致Alzheimer氏病和Hungtinton氏病［6］. 构建ADAR1基因敲除小鼠，可以观察到红细胞发育成熟障碍，小鼠出生后很快死亡. ATOI RNA编辑酶不仅在中枢神经系统，还在免疫系统发挥重要的功能. 有学者［7］报道，重症感染的小鼠肝、脾、胰、淋巴结和胸腺中ADAR1的活性显著升高，表明ADAR1参与了炎症反应过程. 赵青川等［8］研究发现，淋巴细胞内有ADAR1的存在，而且淋巴细胞增殖过程中，ADAR1的活性显著升高，说明ADAR1在淋巴细胞功能方面起着重要的作用，但是淋巴细胞受到异种抗原的刺激后，ADAR1的表达发生什么样的变化，还未见到相关文章报道，本文就此问题设计细胞水平实验来观察相应现象.根据混合淋巴细胞培养原理，两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAII类抗原不同，可以相互刺激对方的T细胞发生增殖，称为双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；也可将不同种类的细胞混合作为刺激细胞，使另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)；两个个体间的HLA抗原相差越大，反应越强烈. 在预实验中，我们尝试用狗血管内皮细胞、大鼠枯否氏细胞及人肝癌细胞分别作为刺激细胞与小鼠脾细胞共培养8 h，结果发现脾细胞ADAR1都显著升高，升高程度是人肝癌细胞>狗血管内皮细胞>大鼠枯否氏细胞. 据此，我们构建了以人HCC作为刺激细胞，小鼠脾细胞为效应细胞的共培养体系，分析不同培养时间的小鼠淋巴细胞ADAR1的表达活性. 我们通过多次重复实验发现：异种抗原确实可以引起淋巴细胞的ADAR1表达活性发生升高，并随着作用时间的延长，抗原对淋巴细胞的刺激作用逐渐减弱，ADAR1的表达也相应的减弱；免疫抑制药物通过抑制淋巴细胞的活性使这种刺激效果发生延迟，从而排除了离体淋巴细胞由于自身代谢而引起ADAR1变化的可能. 但是ADAR1没有出现我们预期的梯形变化，这可能是由于脾细胞成分复杂，除了T淋巴细胞，还有较多的B淋巴细胞、树突状细胞等，而不同种类的淋巴细胞，无论自身ADAR1的表达还是对异种抗原的反应，都有较大的差异.总之，淋巴细胞在异种抗原的刺激下，ADAR1的表达活性是升高的. 由此可推测，ADAR1在免疫排斥反应中发挥一定作用，可能是反映排斥反应强弱的重要指标，抑制ADAR1的表达可能减轻排斥反应的程度. 本实验将ADAR1与淋巴细胞的功能活性联系起来，为下一步在细胞水平研究ADAR1与排斥反应的关系奠定了基础.

    【】

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