小鼠IFN
作者：揣侠，高志云，房文亮，金玉怀，张永红，谢立新，王永祥
【关键词】 干扰素Ⅱ型；肠道病毒B型,人；疫苗,DNA；佐剂,免疫；中和抗体；小鼠
Effect of mouse IFNγ gene adjuvant on immunogenic enhancement of secreting coxsackievirus B3 VP1 DNA vaccine
【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression plasmid pcDNA3/mIFNγ and observe its effect on secreting coxsackievirus B3(CVB3) VP1 gene vaccine. METHODS: mIFNγ cDNA amplified by RTPCR was inserted in eukaryotic expression vector pcDNA3 and then detected after being transfected into cos7 cells with DEAEDextran; Balb/c mice were inoculated in quadriceps muscle at 2week interval for 6 weeks with pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1+ pcDNA3/mIFNγ, respectively. The levels of serum antibodies were detected 13 d after each inoculation.The mice were challenged by 500 TCID50 CVB3 2 weeks after the last immunization. RESULTS: Recombinant pcDNA3/mIFNγ plasmid had been constructed and transcripted and expressed. The neutralizing antibody could be induced by pcDNA3/sVP1 and pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ; The antibody titers increased with the times of inoculation. But there was no difference in the antibody titers and the survival rate between the 2 groups. Coadministration of pcDNA3/mIFNγ and pcDNA3/sVP1 plasmid to Balb/c mice, decreased the titers of virus and reduced the histopathological changes compared with control groups. CONCLUSION: mIFNγ can enhance the immune protection of secreting CVB3 DNA vaccine.
【Keywords】 interferon typeⅡ; enterovirus B, human; vaccines, DNA; adjuvants, immunologic; neutralizing antibody; mice
【摘要】 目的： 构建小鼠IFNγ真核表达质粒，观察其对分泌型柯萨奇病毒B3（CVB3）核酸疫苗的影响. 方法： 以RTPCR扩增小鼠IFNγ基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFNγ，检测其在cos7细胞内的表达；将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1+ pcDNA3/mIFNγ肌注免疫小鼠，每2 wk注射1次，共3次，每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk，以500 TCID50的CVB3腹腔内感染，观察小鼠的存活情况. 结果： 成功构建了pcDNA3/mIFNγ并能有效表达；pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组均能诱导小鼠产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数的增加而提高，但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异；混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组，且心肌病理损伤明显减轻. 结论： IFNγ作为基因佐剂，在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.
【关键词】 干扰素Ⅱ型；肠道病毒B型，人；疫苗，DNA；佐剂，免疫；中和抗体；小鼠
0引言
柯萨奇病毒B组（coxsackievirus B, CVB）是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体. 目前尚无有效的特异性预防措施，而基因疫苗则为预防CVB3感染提供了可能性. 研究者多选择编码CVB3主要的衣壳蛋白VP1基因构建基因疫苗，该疫苗能诱导小鼠产生中和抗体，但抗体效价低［1-2］. 我们将IL2信号肽与CVB3 VP1基因进行拼接，构建成分泌型CVB3 VP1基因疫苗，免疫小鼠产生的抗体效价显著高于非分泌型基因疫苗，但不能完全保护动物抵抗致死量的病毒的攻击［3］. 近来的研究表明，编码细胞因子基因的质粒可增强某些DNA疫苗的免疫效应［4-5］. IFNγ是一种具有重要的免疫调节作用的细胞因子，本研究将IFNγ真核表达质粒与分泌型CVB3 VP1基因疫苗共同注射免疫Balb/c小鼠，观察其对小鼠免疫功能的影响及对CVB3攻击的保护作用.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞株、菌株、病毒株及实验动物大肠杆菌DH5α,真核表达载体pcDNA3,柯萨奇病毒B3 Nancy株, cos7细胞及HeLa细胞由本室保存. Balb/c小鼠，雄性，4~6 wk龄，购自北京肿瘤研究所; pcDNA3/sVP1质粒本室构建.
1.1.2主要试剂和工具酶各种限制性内切酶、AMV 逆转录酶、T4 DNA连接酶等均购自Promega公司，mIFNγ ELISA检测试剂盒为上海森雄公司产品.
1.2方法
1.2.1mIFNγ真核表达质粒的构建根据小鼠IFNγ（mIFNγ）基因序列及pcDNA3序列，并通过Webcutter对全序列进行酶切位点分析后设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成. 其序列为：上游引物5′CACGGATCCACAATGAACGCTACACAC3′（含BamHⅠ位点）；下游引物5′CCGGAATTCTCAGCAGCGACTCCT3′（含EcoRⅠ位点）. 取健康6 wk龄的雄性Balb/c小鼠, 无菌条件下，以毛玻璃片将组织磨碎制成单细胞悬液；用TrisNH4Cl法溶解红细胞，加入含10 μg/mL ConA的完全RPMI1640培养基诱导3 d后，弃去培养液，按异硫氰酸胍一步法提取激活的脾细胞的总RNA, 用RTPCR法扩增，反应循环参数： 94℃, 1 min; 56℃, 1 min; 72℃, 1 min; 30个循环. 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 胶回收法纯化mIFNγ基因片断，与pGEMT载体连接，按常规方法转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒鉴定后回收纯化，送大连宝生物工程有限公司测序. 将正确序列的mIFNγ BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切片段与经过同样酶切的真核表达载体pcDNA3连接，构建真核表达质粒pcDNA3/mIFNγ，转化感受态DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切鉴定.
1.2.2真核细胞转染及检测将pcDNA3/mIFNγ用DEAEDextran法转染cos7细胞，同时设空载体对照、转染试剂DEAEDextran对照和空白对照. 48 h后，提取各组细胞的总RNA，用无RNA酶的胰DNA酶Ⅰ处理后，用RTPCR法检测mIFNγ mRNA的表达. ELISA法检测各组细胞上清中mIFNγ的分泌，操作方法按试剂盒说明书进行.
1.2.3重组质粒免疫小鼠雄性4~6 wk龄Balb/c小鼠100只，随机分成5组，分别为生理盐水组、空载体pcDNA3组、pcDNA3/mIFNγ组、pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/mIFNγ与pcDNA3/sVP1混合注射组，每组20只. 碱裂解法大量抽提上述质粒并以生理盐水进行稀释. 接种部位为小鼠大腿股四头肌，接种前20 min注射250 g/L蔗糖100 μL，然后在同一部位接种质粒100 μg，体积为100 μL，每2 wk加强1次，共3次，每次免疫后的第13日断尾采血，分离血清并采用微量中和试验的方法测定中和抗体滴度.
1.2.4病毒攻击实验第3次免疫后2 wk，以500 TCID50 CVB3的病毒液0.2 mL腹腔注射于小鼠, 观察并记录5组小鼠的存活情况至感染后21 d.
1.2.5小鼠血中病毒滴度的测定小鼠接种病毒第7日，无菌断尾取血，分离血清，将血清用RPMI 1640细胞维持液（含青、链霉素各1×105 U/L, 20 g/L FCS)连续2倍比稀释，由1∶2~1∶256接种HeLa细胞，观察细胞病变，按ReedMuench法病毒滴度.
1.2.6小鼠心脏组织的病检查取不同处理组的小鼠心脏，制备石蜡切片，经HE染色后，于光镜下观察组织病理学改变.
统计学处理： 利用SPSS10.0软件进行分析，数据以x±s表示，中和试验采用方差分析，血中病毒滴度的测定用方差分析和SNKq检验，动物生存率采用 KaplanMeier法进行生存分析.
2结果
2.1mIFNγ cDNA的扩增经ConA活化的小鼠脾细胞经RTPCR扩增，10 g/L琼脂糖凝胶结果显示，在490 bp处可见特异性条带（图1）.
1, 2: mINFγ 片段(490 bp); 3: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker.
图1mINFγ PCR扩增产物（略）
2.2pGEMT/mIFNγ重组质粒BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定可见3.0 kb及490 bp的特异性条带(图2). 测序结果与GenBank中mIFNγ序列完全一致.
2.3真核表达质粒pcDNA3/mIFNγ的构建测序正确的pGEMT/mIFNγ和真核表达载体pcDNA3用BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切后构建成pcDNA3/mIFNγ真核表达载体，DH5α转化扩增后，提取质粒双酶切鉴定，可见约490 bp和5400 bp 2条电泳条带(图3)，表明已正确构建pcDNA3/mIFNγ真核表达载体.
1,2: BamHⅠ+ EcoRⅠ酶切 pGEMT/mIFNγ; 3: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker.
图2pGEMT/mIFNγ酶切电泳结果（略）
1, 2: BamHⅠ+EcoRⅠ酶切pcDNA3/mIFNγ ; 3: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker.
图3pcDNA3/mIFNγ酶切电泳结果（略）
2.4mIFNγ在真核细胞中的表达
2.4.1mIFNγ在cos7细胞中的表达收集转染后的cos7细胞，提取总RNA，用原引物行RTPCR结果显示，pcDNA3/mIFNγ转染组可检测出mIFNγmRNA的表达，而其余3个对照组未见表达(图4).
2.4.2培养上清中mIFNγ的分泌ELISA结果表明，pcDNA3/mIFNγ转染组可检测到mIFNγ分泌，表达量为1.04 mg/L，水平显著超出标准曲线，故结果为估计值，仅供. 空载体对照、转染试剂DEAEDextran对照组分别为0.0016和0.0021 mg/L，提示pcDNA3/mIFNγ成功转染了cos7细胞并表达分泌.
2.5血清中和抗体水平各组小鼠3次免疫期间中和抗体滴度见表1. 从结果可以看出盐水对照、pcDNA3和pcDNA3/mIFNγ均不能诱导小鼠产生抗体，而pcDNA3/sVP1和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ则能诱导小鼠产生抗体，抗体滴度随免疫次数的增加而有所提高，但pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组同pcDNA3/sVP1组相比抗体滴度并没有显著增高（P>0.05）.
1,2,3: 对照组; 4: mIFNγ mRNA; 5: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker.
图4RTPCR检测mIFNγ mRNA在cos7细胞中的表达（略）
表1各次免疫后各组中和抗体平均效价（略）
aP<0.05 vs第一次.
2.6小鼠生存率各组21 d生存率分别为： pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组35%，pcDNA3/sVP1组30%，pcDNA3/mIFNγ组15%，pcDNA3组10%，生理盐水组5%. pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组21 d生存率稍高于其他几组，但用KaplanMeier法进行生存分析，各组间均无统计学差异（P>0.05）.
2.7血中病毒滴度各组小鼠血中病毒滴度见表2；可见pcDNA3/sVP1和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组病毒滴度较3个对照组均有不同程度的降低，以pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组最低，用单因素方差分析及两两比较的SNKq检验对各组病毒滴度的几何均数进行比较，pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组和3个对照组之间均有显著性差异（P<0.05），且pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组（P<0.05），表明IFNγ能够有效地辅助sVP1清除体内的病毒，抑制病毒的复制，降低体内的病毒滴度.
表2不同组小鼠血中病毒滴度（略）
aP<0.05 vs对照, pcDNA3和pcDNA3/IFNγ; bP<0.05 vs pcDNA3/sVP1.
2.8小鼠心肌组织的病观察各免疫组小鼠心肌组织HE染色显示，生理盐水对照组、pcDNA3组、pcDNA3/mIFNγ组均能见明显的心肌病理损伤，表现为心肌细胞呈不同程度的坏死，嗜酸性增强，大量的淋巴细胞浸润，而pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFNγ组无明显的病变及炎性细胞的浸润.
3讨论
病毒性心肌炎的发生与病毒对心肌细胞的直接损伤及免疫病理损伤有关，中和抗体在中和外来病毒，阻止病毒的入侵和感染方面发挥重要的作用. 为了提高中和抗体的表达水平，我们以分泌型CVB3 VP1作为目的基因，构建了分泌型VP1重组真核表达质粒，肌注小鼠后比非分泌型VP1基因诱导了较高水平的中和抗体应答［3］. 主要是借助于hIL2信号肽可以把合成的蛋白质分泌入血后，或被循环系统的抗原提呈细胞（APCs）作为外源性抗原识别摄取，或随血液循环到淋巴结并被那里的APCs所吞噬，之后有效地加工提呈. 但尽管该疫苗刺激机体产生了较高水平的中和抗体而免疫保护作用却不是很理想，为此，我们选择了干扰素γ作为佐剂来增强其免疫效应.
IFNγ是具有多种生物学功能的细胞因子，主要表现为直接抗病毒作用和免疫调节作用. 一些研究者已成功将IFNγ基因作为基因佐剂来增强核酸疫苗的免疫效果［6］. 近年来IFNγ也用于柯萨奇病毒性心肌炎的防治［7-8］，其作用主要是直接抑制病毒复制，这种直接作用主要是产生一些与病毒相互作用的产物或促进受染细胞的凋亡；也可以引起多种细胞表达MHCⅡ类分子，从而提高抗原提呈能力；另外，它可以刺激细胞免疫反应，激活巨噬细胞、NK细胞，增强CTL杀伤活性，清除胞内感染的病毒. 本研究也发现它可以作为基因佐剂对pcDNA3/sVP1基因疫苗有一定免疫增强作用. 不能有效保护小鼠对抗致死量病毒感染推测可能是因为mIFNγ作为Th1型细胞因子，主要增强细胞免疫反应，不能有效诱导高滴度的中和抗体的产生，阻止CVB3感染以及继发的一切病变.
总之，本研究成功构建了pcDNA3/mIFNγ重组真核表达质粒，它虽然不能增强sVP1基因所激发的特异性中和抗体应答，从而抵抗致死量病毒的攻击，但可以抑制病毒复制，降低小鼠体内的病毒滴度，但具体的免疫机制尚需进一步的实验来证实.
【参考】
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