外源性ATP对大鼠移植胰腺的作用及机制
【关键词】 胰十二指肠移植；三磷酸腺苷；细胞凋亡；细胞胀亡
Protective effect of exogenous ATP on transplanted pancreas in rats and its mechanism
【Abstract】 AIM: To study the protective effect of exogenous adenosine triphosphate(ATP) on transplanted pancreas in rats and its mechanism. METHODS: The allogeneic male SD rat models of heterotopic whole pancreaticoduodenal transplantation were established. The isolated pancreas of rats was perfused and stored with calparine balanced solution in which ATP was added as an additive agent in ATP group. No ATP was added to calparine balanced solution in control group. The organs were stored at 0-4℃ for 60 min in both groups. Blood sugar，plasma concentrations of amylase and lipase were examined and histological observation was performed at 0, 1, 6 and 12 h after reperfusion. The concentration of ATP in pancreatic tissue was determined. The percentages of normal, apoptotic and oncotic cells were measured. RESULTS: Light microscopic observation showed that histomorphological changes of pancreas in ATP group were much milder than those in control group. The blood sugar concent, plasma concentrations of amylase and lipase were significantly lower in ATP group than those in control group at 6, 12 h after reperfusion(blood sugar, lipase, P<0.05; amylase, P<0.01). Tissue concentration of ATP in ATP group was higher than that in control group at 0, 1 h after reperfusion(P<0.01). The percentage of oncotic cells was significantly lower in ATP group than that in control group at all time points after reperfusion (0, 1, 6 h, P<0.01; 12 h, P<0.05). Tissue concentration of ATP had a significant negative correlation with the percentage of oncotic cells(r=-0.756, P<0.01), but no evident correlation with the percentage of apoptotic cells. CONCLUSION: Exogenous ATP has a protective effect on transplanted pancreas in rats. The mechanism of the protective effect maybe lies in that ATP can decrease the percentage of oncotic cells.
【Keywords】 pancreaticoduodenal transplantation; adenosine triphosphate; apoptosis; oncosis
【摘要】目的： 探讨外源性三磷酸腺苷(ATP)对大鼠移植胰腺的作用和机制. 方法： 建立SD大鼠同种异位全胰十二指肠移植模型，供体胰腺分别用肝素平衡盐液或肝素平衡盐添加ATP液进行低温(0~4℃)灌注并保存60 min后行移植手术，检测再灌注0, 1, 6, 12 h时血糖、脂肪酶、淀粉酶含量，同时检查胰腺组织病变化，ATP含量及凋亡、胀亡细胞百分数. 结果： ATP组胰腺组织结构损伤明显轻于对照组，ATP 6, 12 h组血糖、血清淀粉酶、脂肪酶含量明显低于同时间点对照组 (血糖，脂肪酶，P<0.05；淀粉酶，P<0.01)，ATP 0, 1 h组胰腺组织ATP含量明显高于同时间点对照组（P<0.01），ATP组各时间点胀亡细胞百分数明显小于同时间点对照组(0, 1, 6 h, P<0.01; 12 h, P<0.05)， ATP含量与胀亡细胞百分数明显负相关（r=-0.756, P<0.01）,与凋亡细胞百分数无明显相关. 结论： 外源性ATP对移植胰腺有保护作用，减少胰腺组织细胞胀亡的发生可能是其重要的保护机制.
【关键词】 胰十二指肠移植；三磷酸腺苷；细胞凋亡；细胞胀亡
0引言
提高移植物低温保存质量，减少移植物细胞死亡是移植成功的重要因素［1-2］. 有资料显示，外源性三磷酸腺苷(ATP)能够进入低温保存的胰腺细胞内［3］. 我们通过补充外源性ATP以提高移植器官内ATP的储备，研究其对胰腺组织中能量代谢以及细胞死亡方式的影响，探讨外源性ATP对移植胰腺的作用及机制.
1材料和方法
1.1材料采用健康清洁级、近交系封闭群SD大鼠96只，均为雄性，体质量250~300 g ，由徐州医学院实验动物中心提供. 实验前1 wk受体大鼠经阴茎背静脉按55 mg/kg 一次注入链脲霉素(美国Sigma公司)制备非空腹血糖>19.4 mmol/L的糖尿病模型. 实验分为2组： 对照组，供体胰十二指肠单纯用4℃肝素平衡盐液（150 ku/L, 15~20 mL)灌注并保存60 min后行移植手术；ATP组，供体胰十二指肠用4℃肝素平衡盐液添加ATP（5 mmol/L, 15～20 mL）进行灌注并保存60 min后行移植手术. 两组按移植后再灌注时间各分为再灌注0, 1, 6, 12 h亚组（每亚组12只大鼠）.
1.2方法采用全胰十二指肠移植模型，供体胰十二指肠根据分组分别用4℃肝素平衡盐液和添加了ATP的肝素平衡盐液灌注并保存60 min. 切除受体左肾,将供体带腹腔动脉和肠系膜上动脉的腹主动脉段与受体腹主动脉端侧吻合，供体门静脉与受体左肾静脉行端端吻合，供体的十二指肠近端关闭，远端与受体Treitz韧带下2 cm空肠作端侧吻合. 分别于设计时间点经下腔静脉采血后处死动物并切取移植胰腺行各项检查. 血糖测定采用美国强生血糖仪，淀粉酶、脂肪酶测定采用日立7600010型全自动生化仪. 切取部分胰腺标本制成石蜡切片后行HE染色，光镜下观察胰腺组织病理学改变. 切取胰腺组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，应用岛津SCL10AVP高效液相色谱仪以反相高效液相色谱法测定胰腺组织ATP含量. 取胰腺组织1 g，生理盐水洗净，剪碎，振荡后300目筛网过滤，收集细胞制成细胞悬液，调整细胞密度至1×109个/L，加标记有异硫氰酸荧光素的联结素V(AnnexinVFITC，上海晶美生物工程有限公司)与碘化丙锭(PI，武汉博士德生物工程有限公司)，混匀双染色. 避光冰浴10 min，使用流式细胞仪上机检测各类细胞百分数. 结果判断：正常活细胞不着色（Annexin V-, PI-）；胀亡细胞能与Annexin V, PI结合，呈强绿色和红色荧光（Annexin V＋, PI＋）；凋亡细胞不与PI结合但与Annexin V结合，显示绿色荧光（Annexin V＋, PI-）.
统计学处理： 数据以x±s表示，采用t检验及相关分析，P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1组织学变化ATP组再灌注0 h时胰腺组织光镜检查未见明显异常，再灌注1 h时胰腺组织结构改变轻微，腺泡轮廓清晰，局部有胰腺小叶间隙增宽，间质无炎性细胞浸润及外渗，6 h时胰腺组织光镜下仍可保持基本正常结构，仅有小叶间隙水肿，少量炎性细胞浸润（图1A），12 h时可见少量出血及炎细胞浸润，偶见腺泡坏死（图1B）. 对照组再灌注0 h时胰腺组织光镜检查未见明显异常，1 h时见胰腺组织结构基本完整，可见较多炎性细胞浸润，6，12 h时组织破坏明显，腺泡坏死、出血和炎症细胞浸润严重（图1C,D）.
2.2血生化变化再灌注后6 h及12 h ATP组血糖、血清淀粉酶和脂肪酶含量均较对照组同时间点明显降低（表1）.
A： ATP组再灌注6 h；B： ATP组再灌注12 h；C： 对照组再灌注6 h；D： 对照组再灌注12 h.
图1组织学变化（略）
表1移植胰腺再灌注后血糖、血清淀粉酶和脂肪酶含量变化（略）
aP<0.05,bP<0.01 vs对照.
2.3胰腺组织ATP和各类细胞的变化ATP组再灌注0, 1 h时胰腺组织ATP含量较对照组明显增高（P<0.01），ATP组各时间点胀亡细胞百分数较对照组均明显降低（P<0.05），ATP含量与胀亡细胞百分数明显负相关（r=-0.756, P<0.01）,与凋亡细胞百分数无明显相关（表2）.
表2大鼠移植胰腺再灌注后胰腺组织ATP及各类细胞的变化（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs对照.
3讨论
胀亡细胞与凋亡细胞胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于细胞膜外，标记有FITC的Annexin V可特异结合PS；胀亡细胞细胞膜通透性改变，PI可以穿过细胞膜结合在DNA 双股螺旋链之间. 以上2种染料对单细胞悬液进行双染色，则胀亡细胞可同时结合上述2种染料，凋亡细胞由于细胞膜完整，只能结合AnnexinVFITC，正常细胞则两种染料均不染色，据此可以应用双染色法通过流式细胞仪3种细胞百分数. 本实验结果表明，再灌注后ATP组胰腺组织病理改变明显轻于对照组；再灌注6, 12 h后ATP组血糖、淀粉酶、脂肪酶比对照组明显降低，以上结果说明在灌注保存液中添加外源性ATP能够减轻移植胰腺缺血再灌注损伤. 结果同时显示，ATP组保存后胰腺组织中ATP水平比对照组明显升高且再灌注以后ATP水平恢复较对照组快；ATP组胀亡细胞百分数明显小于对照组，ATP水平与胀亡细胞百分数明显负相关，提示外源性ATP对大鼠移植胰腺的保护作用可能在于ATP能够减少细胞胀亡的发生.
诸多研究认为，ATP水平影响细胞死亡方式，细胞凋亡是细胞消耗ATP的主动死亡，细胞胀亡是细胞缺乏ATP的被动死亡［4］. 我们的结果表明，ATP组保存后的胰腺组织能量状态优于移植对照组，提示ATP充足时组织细胞以凋亡这一主动死亡方式清除受损细胞，ATP不足时,凋亡无法完成其程序,细胞转向胀亡. 关于细胞死亡方式，尚有许多未知领域，有待更深入的研究. 本实验仅提示当缺血再灌注损伤不可避免时,首先应减少缺血所引起缺氧及能量消耗这一始动因素，如在术前或术中给予能量物质暂时提高组织细胞能量储备，有利于减少细胞胀亡，减轻炎症反应,防止移植器官缺血/再灌注损伤.
【】
［1］ Uhlmann D, Armann B, Ludwig S, et al. Comparison of Celsior and UW solution in experimental pancreas preservation［J］. J Surg Res, 2002,105(2):173-180.
［2］ Troisi R, Meester D, Regaert B, et al. Tolerance of the porcine pancreas to warm and cold ischemia: Comparison between University of Wisconsin and histidinetryptophanketoglutarate solution［J］. Transplant Proc, 2002,34(3):820-822.
［3］ 原春辉，刘永锋，李桂臣,等. 外源性腺苷三磷酸对移植胰腺再灌注损伤保护作用的实验研究［J］. 消化外科,2004,3(4):274-277.
［4］ Hein S, Arnon E, Kostin S, et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure overloaded human heart: Structural deterioration and compensatory mechanisms［J］. Circulation, 2003,107(7):984-991.
