人胎盘绒毛提取物体外对T细胞应答的抑制效应
【关键词】 胎盘绒毛；滋养层；免疫抑制；T淋巴细胞；色氨酸加氧酶
【Abstract】 AIM: To have a progressive knowledge of the inhibitory capacity of placental villi on T cell response and its changes in the 3 trimesters of pregnancy. METHODS: Tissue extracts were prepared from early (10 weeks), middle (20 weeks) and late (37 weeks) placental villi, and their impacts on T cell activation were evaluated by detecting CD69 and CD25 expressions, impacts on proliferation were analyzed by method of WST1, and impacts on Th1/Th2 cytokine repertoire were measured by cytometric bead array (CBA). Content of indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) in the tissue extracts was detected by Western blotting. RESULTS: All tissue extracts from the 3 trimesters showed inhibitory effects on activation, proliferation and cytokine secretion of human peripheral T cells stimulated by PHA, and also on activation of mouse T cell activation stimulated by ConA (P<0.01). In general, the 20 week extracts had the strongest immunosuppressive effects. The content of IDO was much more in 20 week extracts than in 37 week extracts, and there was only trace amount of IDO in 10 week extracts. CONCLUSION: Villous extracts from the 3 trimesters of pregnancy had different degrees of inhibitory effects on T cell response, and their inhibitions to different T cell behaviors were not consistent, indicating their different expression patterns (quality and quantity) of inhibitory factors.
【Keywords】 placental villus; trophoblast; immunosuppression; T lymphocytes; tryptophan oxygenase
【摘要】 目的： 了解胎盘绒毛对T细胞应答的抑制能力及其在妊娠周期不同阶段的变化. 方法： 制备孕10，20和37 wk的绒毛提取物，通过检测CD69和CD25分子的表达，评价其对T细胞活化的影响，WST1法分析其对T细胞增殖的影响，流式微球阵列（CBA）法分析其对Th1/Th2细胞因子谱的影响，并以Western印迹法分析提取物中吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）的含量. 结果： 孕早、中、晚期的胎盘绒毛提取物均能显著抑制植物血凝素(PHA)诱导的人T细胞活化，增殖，细胞因子分泌以及ConA诱导的小鼠T细胞活化（P<0.01）. 但三个时期的提取物对上述不同T细胞行为的抑制强度不同，以20 wk提取物的抑制作用最强. 提取物中IDO蛋白的含量20 wk最高，37 wk次之，10 wk最低. 结论： 妊娠不同时期的绒毛滋养细胞均能够抑制T细胞应答，但抑制强度不一致，且对T细胞不同行为的抑制存在分离现象，提示妊娠不同时期的绒毛滋养细胞表达抑制因子的模式不同.
【关键词】 胎盘绒毛；滋养层；免疫抑制；T淋巴细胞；色氨酸加氧酶
0引言
在胎盘局部，受精卵来源的绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞作为胎儿细胞的代表，处于母胎界面的最前沿，因此已成为研究母胎耐受机制中胎儿因素的最重要靶点. 虽然已知绒毛滋养细胞表达HLAG, FasL, 吲哚胺2,3双加氧酶（indoleamine 2,3dioxygenase, IDO），以及分泌高浓度的雌、孕激素都可能参与了降低母体免疫系统对胎儿抗原的应答［1-4］，但以往研究多是对上述单个因素的作用进行分析，而对胎盘绒毛所具有的整体的免疫抑制能力，及其在妊娠不同阶段有何变化等问题的研究报道较少. 本研究拟从胎盘绒毛提取物的角度，对妊娠早、中、晚期胎盘绒毛的细胞免疫抑制能力进行评价，并希望通过此研究思路为发现新的免疫耐受相关机制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料K2EDTA抗凝静脉血取自8例健康志愿者，男性，年龄18~35岁；SPF级Balb/cJ近交系小鼠，雄性，8~10 wk，购自南方医科大学实验动物中心；碘化丙锭（propidium Iodide, PI）、刀豆蛋白A（ConA）、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）均购自美国Sigma公司；NycoPrepTM淋巴细胞分离液购自挪威Nycomed Pharma AS公司；WST1购自德国Boehringer Mannhein公司；人Th1/Th2细胞因子流式微球检测（cytometric bead array, CBA）试剂盒以及抗人和抗小鼠CD3FITC, CD69PE, CD25PE mAb均购自美国BD PharMingen公司；兔抗IDO 抗体购自美国CHEMICON 公司；小鼠抗βactin 抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG, HRP标记的兔抗小鼠IgG均购自美国Santa Cruz公司；RPIM 1640培养基，胎牛血清购自美国GIBCO BRL公司；BIORAD 3550 酶标仪，Amersham MiniVE垂直板电泳仪，FACSCalibur型流式细胞仪.
1.2方法
1.2.1胎盘绒毛提取物的制备绒毛组织取自人工流产（孕10 wk）、孕中期水囊引产（孕20 wk）和行择期剖宫产（孕37 wk）的妇女. 剪取末梢细小绒毛组织，大量冷PBS多次冲洗，再将其剪碎，经超声破碎制成匀浆，以上操作均在冰浴中进行. 4℃，15 000 g，离心15 min吸取上清，经0.22 μm滤膜过滤，分装，-20℃保存. 检测蛋白浓度约为0.2 g/L.
1.2.2T细胞活化和增殖诱导及实验分组分离健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC），或从小鼠淋巴结制备淋巴细胞，以含100 mL/L FBS的RPMI 1640完全培养液悬浮，细胞密度为1.5×109 /L，96孔板培养，每孔定容200 μL. 设置不加刺激剂的空白对照组（control）和不加刺激剂但加入不同体积百分比（5%, 10%, 15%）绒毛提取物（孕10, 20或37 wk）的实验组，以及加刺激剂的（PHA/ConA）对照组和加刺激剂同时加入不同体积百分比绒毛提取物的实验组，每组设4个复孔. 刺激人T细胞活化和增殖用PHA 10 mg/L，刺激小鼠T细胞活化和增殖用 ConA 5 mg/L.
1.2.3流式细胞术分析T细胞活化人PBMC或小鼠淋巴细胞按方法1.2.2进行分组培养， 6 h后收集细胞，常规方法标记抗人或抗小鼠的CD3FITC, CD69PE抗体，培养24 h后按相同方法标记CD3FITC, CD25PE抗体，流式细胞术分析CD69和CD25阳性T细胞百分率.
1.2.4WST1法检测T细胞增殖健康人PBMC按方法1.2.2进行分组培养，每孔定容100 μL，各组设置5个复孔. 培养48 h后每孔加入10 μL WST1，轻轻振荡，37℃继续孵育2 h，用酶标仪进行检测. 检测波长为450 nm，波长为600 nm.
1.2.5PI染色检测细胞活力收集培养的PBMC, PBS离心洗涤1次，380 μL PBS重悬，加入50 mg/L的PI染液20 μL混匀，5 min后即用流式细胞仪进行检测. PI染色阳性细胞为死细胞.
1.2.6流式微球法检测培养上清中的细胞因子健康人PBMC按方法1.2.2进行分组培养，6 h和24 h分别收集培养上清，使用人 Th1/Th2 CBA 试剂盒，按［5］，检测IL2, IL4, IL5, IL10, TNFα和IFNγ6种细胞因子的浓度，检测范围为20~5000 pg/mL.
1.2.7Western印迹法检测绒毛提取物中的IDO蛋白将绒毛提取物10倍浓缩，100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白，每道上样量20 μg，以βactin Mr约为43作为内参，因其与IDO蛋白Mr约为45接近，因此利用2块胶以相同条件进行. 电转移法将胶上蛋白条带转移到PVDF膜上，TBS液漂洗，50 g/L脱脂奶粉封闭，TBS液漂洗，一抗（兔抗IDO 0.5 μg/mL或小鼠抗βactin 1∶100稀释）孵育60 min. TBS液洗膜后，二抗（HRP标记的羊抗兔 IgG 1∶1000稀释, 兔抗小鼠 IgG 1∶5000稀释）孵育60 min. TBS液漂洗，ECL发光，X光片显像，分析成像.
统计学处理： 统计软件为SPSS12.0，获得的数据用x±s表示，统计方法用方差分析.
2结果
2.1胎盘绒毛提取物对人T细胞活化的影响各期的绒毛提取物对静息态的人T细胞CD69和CD25分子表达（CD69+T细胞为7%左右，CD25+T细胞为9%左右）均无显著影响，但对PHA诱导的T细胞CD69和CD25表达均具有显著的抑制作用（P<0.01）. 表1显示各组抑制率，抑制率按［(PHAControl)(PHA+%extractControl)/(PHAControl)］×100%计.
2.2胎盘绒毛提取物对人T细胞增殖的影响鉴于15%的绒毛提取物对T细胞活化的抑制作用过强，因此选取5%和10%这2个浓度研究其对T细胞增殖的影响. 培养48 h后，WST1法检测各孔细胞吸光值. PHA对照组与空白对照组比较细胞明显增殖（P<0.01）；加入5%或10%各期绒毛提取物，PHA诱导的增殖被明显抑制（P<0.01），其中以20 wk提取物的抑制作用最强（图1）.表1不同体积百分比各期绒毛提取物对PHA诱导的人T细胞CD69和CD25表达的抑制率 图1胎盘绒毛提取物对PHA诱导的人T细胞增殖的影响
2.3胎盘绒毛提取物对小鼠T细胞活化的影响10%体积比的各期胎盘绒毛提取物对ConA诱导的小鼠T细胞CD69和CD25表达均具有显著的抑制作用（P<0.01，图2）. bP<0.01 vs ConA.图2胎盘绒毛提取物对ConA诱导的小鼠T细胞活化的影响
2.4胎盘绒毛提取物对细胞活力的影响培养24 h后，加入不同百分比20 wk提取物的各组死亡细胞百分率略高于空白对照组（P<0.05）；PHA对照组死亡细胞百分率明显高于空白对照组（P<0.01），但PHA加提取物的各组死亡细胞百分率均明显低于PHA对照组（P<0.01，图3）.
2.5孕早、中、晚期胎盘绒毛提取物IDO蛋白含量Western 印迹法检测，20 wk提取物中IDO蛋白的含量最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO蛋白（图4）. 图4各期胎盘绒毛提取物中IDO蛋白的相对含量
2.6胎盘绒毛提取物对PBMC分泌细胞因子的影响培养6 h后，未加刺激剂的各组无论有否加胎盘绒毛提取物，培养上清中6种细胞因子均未检出；培养24 h后，空白对照组培养上清IFNγ为（54.2±5.1） pg/mL，加入10%体积各期提取物后，均检测不出. 经PHA刺激6和24 h后，10%体积比各期提取物对细胞因子的影响见表2. 全部样品IL4, IL5和IL10均未检出.表2各期10%胎盘绒毛提取物对细胞因子分泌的抑制作用
3讨论
胎儿对于母体来说相当于半同种异基因移植物，而同种移植排斥反应的实质是受者T细胞介导的针对供者同种异基因抗原的免疫应答，因此本课题主要研究绒毛提取物对T细胞应答的影响. 结果显示，孕早、中、晚期的胎盘绒毛提取物均能抑制PHA诱导的人外周血T细胞活化、增殖和细胞因子分泌，而且这些作用并非由细胞毒性引起. 提示在母胎免疫耐受的维持中，胎儿来源的滋养细胞除不表达某些主要的MHC I类分子而减少母体免疫系统的攻击外，还具有一套能够主动抑制母体免疫攻击的“防御系统”. 人胎盘绒毛提取物对小鼠T细胞活化的抑制作用提示，绒毛提取物中存在一些保守的、无种属特异性的免疫抑制因素，如高浓度的雌、孕激素对人和小鼠的T细胞活化、增殖均具有抑制作用［6］.
IDO是细胞内一种催化色氨酸（Trp）沿犬尿氨酸途径降解的限速酶，体内、外研究都表明，IDO能够抑制T细胞增殖，是机体天然存在的免疫抑制机制［3，7］. 一般认为，IDO抑制T细胞增殖的原因是它降解Trp，造成缺乏Trp的微环境，这对一般细胞影响似不明显，而T 细胞由于存在一个对Trp 敏感的检查点，使细胞增殖停滞于G1期中期［8］. 胎盘滋养层细胞产生的IDO能阻断针对胎儿组织表达的父本HLA等位基因产物的母体活化T细胞攻击，因而是防止母体T细胞排斥同种异基因胎儿的必要因素［4］. 本研究结果显示，20 wk提取物中IDO的浓度最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO，与报道的IDO于胎盘种植后13 wk时才明显表达相符［9］. 这一结果与前述绒毛提取物对T细胞增殖的抑制能力20 wk最强，37 wk次之，10 wk最弱有很好的一致性；由于IDO并不影响T细胞的活化［10］，因此，与前述37 wk和10 wk提取物对T细胞活化的抑制效应相近并不矛盾，20 wk提取物对活化的抑制作用最强可能是由提取物中的其他因素引起的.
本研究发现，妊娠不同时期的胎盘绒毛提取物对T细胞不同行为的抑制效应存在分离现象，提示妊娠不同时期滋养细胞表达抑制因子的模式（质和量）不同，不同时期提取物中IDO含量的差异就是一个例子. 母胎耐受是多种因素整合的结果，在妊娠期的不同时空组合中，各种耐受机制可能有着不同的贡献度. 以胎盘绒毛提取物为切入点，借助蛋白组学等高通量的研究手段，很可能发现新的耐受相关分子和耐受相关机制.
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