锰对PC12细胞生长增殖及对ERK信号转导通路的影响

             作者：李妍，陈景元，蔡同建，郑刚，杜可军，骆文静 

【关键词】  MnCl2；大鼠；嗜铬细胞瘤PC12细胞；p

     【Abstract】 AIM: To study the toxicity of different doses of MnCl2 on rat pheochromocytoma PC12 cells in vitro and their effects on signal transduction of extracellular signalregulated kinase 1/2 (ERK1/2). METHODS: PC12 cell cultures were exposed to MnCl2 within the range of 100900 μmol/L. The inhibition of the cells during 7 d was determined by MTT assay and plate clone formation test, and ERK1/2 and pERK1/2 were determined by Western blot. RESULTS: MnCl2 at different concentrations (100, 300, 500, 700 and 900 μmol/L) could inhibit the growth and proliferation of PC12 cells in a dose and timedependent manner and the cell growth curves were changed accordingly (P<0.05). Western blot showed that MnCl2 decreased pERK1/2 expression in a dosedependent manner(P<0.05). CONCLUSION: MnCl2 can significantly inhibit the growth and proliferation of PC12 cells, possibly by downregulating pERK1/2 expression.

    【Keywords】 MnCl2; rats;  pheochromocytoma PC12 cell; pERK1/2

    【摘要】 目的： 研究不同浓度的锰对PC12细胞生长增殖及细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)信号转导通路的影响.  方法： 体外培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，以100~900 μmol/L MnCl2染毒后进行四唑盐比色实验(MTT)筛选锰的细胞毒性剂量，平板克隆形成实验观察MnCl2对细胞的抑制作用. Western blot检测ERK1/2及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (pERK1/2)表达情况. 结果： MTT、平板克隆形成实验结果显示100～900 μmol/L MnCl2对细胞的生长增殖有不同程度的抑制作用(P<0.05). Western blot结果显示随着染锰浓度的增高，PC12细胞pERK1/2表达量与对照组相比有显著性差异(P<0.05). 结论：  一定浓度的MnCl2对PC12细胞的生长增殖有明显的抑制作用，这一作用可能是通过下调胞内pERK1/2表达实现的.

    【关键词】 MnCl2；大鼠；嗜铬细胞瘤PC12细胞；pERK1/2

      0引言

    慢性锰中毒主要作用于黑质神经元，引起类帕金森病样症状［1］. 这主要是由于黑质含色素的神经元具有蓄积金属元素的特性. 近来有研究发现适量的锰可以抑制神经细胞增殖，引起神经细胞凋亡［2］. 丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases, MAPKs)信号转导通路在胞浆信号转导中起重要作用［3］，其中，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)在所有MAPKs家族成员中最早被认识，且最具特征性. 被认为是一种增殖、转化和分化MAPKs［4］.

    本研究以多巴胺能PC12细胞为研究对象，观察染锰不同浓度及不同时间对细胞增殖的毒性作用和对胞内ERK1/2磷酸化水平的影响，探讨锰对神经系统损伤的可能机制，为阐明锰神经毒作用的分子机制,寻求的诊断和方法提供新的线索.

    1材料和方法

    1.1材料高分化PC12细胞购自科学院上海生命科学研究院；胎牛血清，杭州四季青公司产品；DMEM培养基，美国Gibco公司产品；细胞培养箱，英国Forma Scientific公司产品；MTT，美国Sigma公司产品；ERK1/2抗体(兔单抗)及p ERK1/2抗体(鼠单抗)购于美国Cell Signaling公司.

    1.2方法

    1.2.1MTT法绘制细胞生长曲线PC12细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，于含50 mL/L CO2的37℃孵箱中湿化培养，取对数生长期的细胞按5×103个/孔接种于96孔板(Costar)中，待细胞铺满50%后，对照组仍以原培养基继续培养，各给药组分别给予含100, 300, 500, 700和900 μmol/L MnCl2的培养基进行四唑盐比色实验，用酶联免疫检测仪以490 nm波长测定各孔的吸光值(A值)，记录结果. MnCl2对细胞增殖的毒性作用以抑制率(IR)表示，其公式如下： IR(%)＝(A对照组-A给药组)/A对照组×100          并以时间为横轴，A值为纵轴，使用Microsoft Excel软件绘制细胞生长曲线.

    1.2.2平板克隆形成实验检测细胞活力对数生长期PC12细胞500个/孔接种在24孔板(Costar)中，每组细胞各铺3孔. 培养24 h后换以0, 100, 300和500 μmol/L MnCl2培养液，分别培养24, 48和72 h后，换以不含MnCl2的培养液，继续培养12～15 d，弃去培养液，PBS(0.01 mol/L, pH 7.4)小心浸洗2次. 加纯甲醇5 mL固定15 min. 弃去固定液，加适量姬姆萨应用液染色20 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥. 显微镜下计数>50个细胞的克隆数，每组实验重复3次，计算克隆形成率及抑制率.

    1.2.3Western blot检测ERK1/2及pERK1/2表达水平PC12细胞分别以含0, 100, 300和500 μmol/L MnCl2的DMEM培养基培养3 d后，用预冷的PBS吹打收集细胞，预冷的裂解液每组100 μL冰上裂解10 min，用改进的Folin酚法定量蛋白，每组样品取25 μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰水浴条件下电转. 将NC膜以50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h. 将ERK1/2及 pERK1/2一抗分别用封闭液按1∶1000稀释后加于NC膜上，4℃过夜；用封闭液洗膜3次×8 min，将二抗用封闭液按比例稀释后滴加于NC膜上，37℃作用1 h； TBS洗膜3次×8 min. 待NC膜稍干后，在膜上滴加1 mL化学荧光液，反应约4 min后用保鲜膜覆盖，在暗盒中用X光胶片压片成像. 后显影、定影. 图像经GeneGenius凝胶成像分析系统进行分析.

    统计学处理： 实验数据均以x±s表示；使用SPSS11.0软件进行重复测量方差分析，组间比较采用Dunnettt检验.

    2结果

    2.1细胞生长曲线MTT结果显示，与对照组细胞相比，100～900 μmol/L  MnCl2溶液对PC12细胞的生长有着不同程度的抑制作用，对照组细胞在接种后生长迅速，细胞数明显增多，而各给药组细胞生长均受到不同程度的抑制. 而且随着MnCl2剂量的增加和给药时间的延长，抑制作用越来越明显(P<0.05,图1).

    2.2平板克隆形成实验如表1所示，随着染锰浓度的增加及时间的延长,与对照组相比，克隆形成数逐渐减少，100～500 μmol/L MnCl2对PC12细胞有抑制作用，但程度不同，各剂量组锰对细胞的抑制率均低于60%.  3个剂量组对细胞的抑制率随作用时间的延长和浓度的上升而增加. 各实验组与对照组相比有显著性差异(P<0.05).表1锰对PC12细胞生长的抑制率

    2.3MnCl2引起PC12细胞pERK1/2表达水平降低PC12细胞给予0, 100, 300和500 μmol/L MnCl2作用3 d时，Western blot结果显示细胞pERK1/2表达水平逐渐降低.  100, 300和500 μmol/L MnCl2组pERK1/2表达水平分别下降至对照组的0.616±0.028, 0.468±0.031, 0.244±0.017 (n=3,  x±s, P<0.05，图2).

    3讨论

    近年来，尽管来源的锰污染已明显减少，但随着汽车工业的迅猛，含MMT(三羟基甲基戊基锰)无铅汽油的广泛使用使环境中的锰含量增加，导致锰环境污染不断加剧［5］.锰主要作用于大脑纹状体苍白球和黑质网状带，引起该部位的多巴胺能神经损伤，多巴胺生成降低［6］. 此外，长期接触锰尘、锰烟还可刺激肺泡上皮引起尘肺病；流行病学调查显示，长期接触锰对男性和女性均可造成生殖功能的损害. MAPKs是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，在胞浆信号转导中起重要作用，被认为是与细胞增殖、分化或凋亡调控密切相关的细胞信号转导途径，是胞外信号引起细胞增殖分化等细胞核反应的共同途径或汇聚点［7］. 哺乳动物细胞MAPKs信号转导通路主要有Ras/ERK1/2, JNK/SAPK和p38MAPK三条途径，其中Ras/ERK1/2的磷酸化活化对于促进细胞增殖和蛋白质合成有重要作用［4］.

    在本实验中，细胞生长曲线变化情况证实在100~900 μmol/L剂量范围内，MnCl2可以对PC12细胞的生长增殖产生抑制作用，而且呈时效和量效关系；平板克隆形成实验进一步证实了100～500 μmol/L的MnCl2对PC12细胞活力抑制作用的时间效应和剂量效应关系. Western blot结果显示，随着染锰浓度的增高，pERK1/2表达量逐渐降低. 以上结果反映了MnCl2对PC12细胞生长增殖抑制作用呈时效和量效关系的特点，同时提示这种毒性作用可能与ERK1/2磷酸化抑制密切相关.

    综上所述，我们认为一定浓度的MnCl2可以显著抑制PC12细胞的生长增殖，而pERK1/2在细胞中表达的下调可能是MnCl2对多巴胺能神经细胞产生毒性作用的重要机制之一.

    【】

    ［1］ Chu NS, Chang LW. Handbook of neurotoxicology ［B］. New York：Mekker In, 1995,77:95-104.

    ［2］ HirataY. Manganeseinduced apoptosis in PC12 cells ［J］. Neurotoxicol  Teratol, 2002,24:639-653.

    ［3］ Nichols A, Camps M, Gillieron C, et al. Substrate recognition domains within extracellular signalregulated kinase mediate binding and catalytic activation of mitogen activated protein kinase phosphatase3 ［J］. J Biol Chem, 2000,275(32):24613-24621.

    ［4］ Kolch W. The regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions ［J］. Biochem J, 2000,351:289-305.

    ［5］ Zayed J, Guessous A, Lambert J, et al. Estimation of annual Mn emissions from MMT source in the Canadian environment and the Mn pollution index in each province ［J］. Sci Total Environ, 2003,312(13):147-154.

    ［6］ Nagatomo S, Umehara F, Hanada K, et al. Manganese intoxication during total parenteral nutrition: Report of two cases and review of the literature ［J］. J Neurol Sci, 1999,162:102-105.

    ［7］ Adachi T, Kar S, Wang M, et al. Transient and sustained ERK phosphorylation and nuclear translocation in growth control ［J］. J Cell Physiol, 2002,192(2):151-159.