模拟失重对成骨细胞整合素亚单位表达的影响

             作者：杨志，王冰，李莹辉，聂婕霖，孙喜庆，张舒

【关键词】  失重；成骨细胞；整合素类

    【Abstract】 AIM: To investigate the  expression of integrin subunits in osteoblasts during simulated weightlessness induced by clinostat. METHODS: Calvarial osteoblasts of neonate rats were cultured under conditions of normal gravity(1G) and simulated weightlessness induced by clinostat respectively. The total RNA in cells was isolated in different time points (24, 48, 72 h). Reverse transcription PCR analysis was made to examine the gene expression of α5, αv and β1  integrin subunits. Each value was normalized against that of βactin mRNA. Moreover, the protein expressions of all kinds of integrin subunits were also detected with Western blotting.  RESULTS: The gene expression of 3 integrin subunits started to change from 24 h of rotation in clinostat but not in stationary cultures. The expression of integrin α5 mRNA decreased at 24, 48 and 72 h of rotation by 11.3%, 18.7% and 9.8%, respectively. The same trend was saw in the expression of integrin αv mRNA as 23.0%, 12.3% and 16.7%, respectively. Moreover, the expressions of integrin β1 mRNA in different periods were also declined by 15.3%, 11.4% and 26.4%, respectively. The differences were all statistically significant as compared with controls (P<0.05). The protein expression of 3 integrin subunits also started to change from 24 h of rotation in clinostat. The expression of integrin α5 at 24, 48 and 72 h decreased by 13.1%, 20.3% and 11.9%, respectively. The same trend was seen in the expression of integrin αv as 7.4%, 18.2% and 25.2%, respectively. Moreover, the expressions of integrin β1  protein  in different periods were also declined by  18.6%, 25.9% and 27.5%, respectively.  The differences were all statistically significant as compared with controls (P<0.05). CONCLUSION: The expressions of α5, αv, β1 integrin subunits decrease in simulated weightlessness.

    【Keywords】 weightlessness; osteoblasts; integrins

    【摘要】 目的： 观察回转器模拟失重对成骨细胞整合素亚单位表达的影响. 方法： 培养的大鼠乳鼠颅骨成骨随机分为对照组和失重组（用回转器模拟失重条件），在实验的24, 48和72 h提取细胞总RNA，进行反转录PCR，检测整合素的α5, αv和β1亚单位mRNA表达，并与内参照β肌动蛋白 (betaactin) mRNA水平的比值. 同时用Western blotting检测各种整合素亚单位的蛋白表达变化. 结果： 从模拟失重24 h开始，整合素亚单位的基因表达即发生改变，但在对照组中，基因表达无明显变化. 整合素α5 mRNA在模拟失重的24, 48和72 h分别下降了11.3%, 18.7%和9.8%；整合素αv mRNA分别下降了23.0%, 12.3%和16.7%；整合素β1 mRNA分别下降了15.3%, 11.4%和26.4%. 与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）. 整合素亚单位蛋白和基因表达的变化相似. 整合素α5在模拟失重的24, 48和72 h分别下降了13.1%, 20.3%和11.9%；整合素αv的蛋白表达分别下降了7.4%, 18.2%和25.2%；整合素β1蛋白表达分别下降了18.6%, 25.9%和27.5%. 与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）. 结论： 在模拟失重环境下，整合素α5, αv和β1亚单位mRNA的表达发生了下调性变化.

    【关键词】失重；成骨细胞；整合素类

      0引言

    在失重环境下，骨骼组织发生显著的变化：骨骼脱钙、骨量减少及力学性能下降，严重影响骨骼的结构和功能，威胁航天员返回地球后的安全［1］. 骨骼脱负荷引起的临床及失重环境下的骨质丧失已成为妨碍人类健康和太空探索能力的难题之一. 目前有许多研究表明，失重和模拟失重导致的骨丢失是一个以骨形成抑制起主导作用的过程，特别是成骨细胞的增殖、分化功能以及细胞内细胞骨架的聚合与解聚受到了抑制，而成骨细胞的代谢紊乱，又进一步抑制了细胞的骨骼形成能力. 在航天医学领域，有关成骨细胞在失重或模拟失重环境下整合素变化的研究鲜见报道. 本实验利用大鼠乳鼠颅骨成骨细胞，观察模拟失重环境对细胞整合素亚单位基因表达的影响，以探讨失重致骨骼结构改变的可能细胞学机制.

    1材料和方法

    1.1材料达尔伯克必需基本培养基 (dulbeccos modified eagle medium, DMEM)由Biotech生产；RNA提取试剂盒（批号：D312T）,RTPCR试剂盒（批号：#A1260）为美国Promega公司产品；整合素的α5, αv, β1亚单位和β肌动蛋白引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，PAGE法纯化.

    1.2方法

    1.2.1成骨细胞的分离SD大鼠乳鼠4只由第四军医大学动物中心提供，体质量不限. 利用多段酶消化法无菌摘取大鼠乳鼠颅骨并去除骨膜. 将颅骨碎片用2.5  g/L胰蛋白酶消化90 min，去除上清液后，颅骨碎片用2.5 g/L的胰蛋白酶和1 g/L  I型胶原酶混合液消化30 min，重复4次. 将消化上清液1000 r/min离心5 min，将细胞加入含100 mL/L胎牛血清(FBS), 100 U/mL青霉素及0.01 mg/mL链霉素的DMEM培养液，按细胞数2×105个细胞/瓶接种于25 mL培养瓶中.

    1.2.2成骨细胞的培养细胞在37℃ 50 mL/L CO2恒温孵箱中孵育并及时进行传代. 经37℃ 50 mL/L CO2恒温孵箱中培养46 h后，细胞换液，每瓶灌满含100 mL/L FBS的DMEM培养基，密封瓶口. 再随机分为2组（每组12瓶细胞，约3×106个细胞）：模拟失重组（利用回转器模拟失重环境［2］），1 G重力组（对照组），置于相同的培养条件下培养. 回转器以30 r/min水平旋转. 在不同重力环境培养72 h后，进入下一步实验.

    1.2.3PCR反应参照试剂盒说明提取总RNA. 在紫外分光光度仪上测定260 nm处的吸光度，RNA的浓度（μg /mL）=A260 nm×40 μg/mL×稀释倍数. 计算并将各组样本RNA调节为相同浓度，进行RTPCR反应. 过程： ① 48℃, 45 min, 反转录；94℃, 2 min, AMV反转录酶失活；② 94℃, 30 s, 变性；Tm=X℃,1 min，退火；68℃, 2 min，延伸；此过程共35个循环；③ 68℃, 7 min，延伸. Tm代表退火温度. PCR反应结束后将相同量DNA产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，通过凝胶成像系统采集图像，用ImageMaster TotalLab v1.11软件(totallab凝胶成像软件，美国)测定电泳条带的灰度值，计算整合素亚单位cDNA产物与内对照β肌动蛋白cDNA产物的灰度比值. 从而反映整合素亚单位mRNA的表达量.

    1.2.4蛋白免疫印迹样本提取了RNA后，进行蛋白的提取. 配制120 g/L聚丙烯酰胺凝胶，各取细胞蛋白420 μg进行SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳），电泳结束后用2.5 g/L考马斯亮蓝R250染色，观察蛋白含量.用BioRad Mini电泳仪在冰上将细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜上，120 V, 2.5 h. TTBS洗膜, 6次/5 min. 用50 g/L脱脂奶粉，室温封闭1 h. 加兔抗鼠整合素α5, αv, β1血清(1∶500稀释)室温反应1 h后，TTBS洗膜,6次/5 min. 加HRP羊抗兔IgG(1∶5000稀释)室温反应1 h; TBS洗膜,6次/5 min.最后加入化学发光试剂，置室温5 min后，X片显影，定影.

    统计学处理: 相同条件的实验重复3次（n=3），实验数据以x±s表示，组间比较利用SPSS10.0统计软件进行t检验检测各组间差异，显著性检验水准α＝0.05.

    2结果

    2.1模拟失重对大鼠乳鼠颅骨成骨细胞整合素亚单位mRNA表达的影响从模拟失重24 h开始，整合素α5, αv, β1基因表达即发生改变，与对照组相比，α5 mRNA在模拟失重的24, 48和72 h分别下降了11.3%, 18.7%和9.8%，差异均有统计学意义（P<0.05）. α5 mRNA的表达随模拟失重时间的延长呈现一定的波动变化趋势. αv mRNA在模拟失重的24 h, 48 h和72 h分别下降了23.0%, 12.3%和16.7%，差异均有统计学意义（P<0.05）. αv mRNA的表达随模拟失重时间的延长呈现逐步增加的变化趋势. β1 mRNA在模拟失重的24，48和72 h分别下降了15.3%, 11.4%和26.4%，差异均有统计学意义（P<0.05）. β1 mRNA的表达随模拟失重时间的延长亦呈现逐步增加的变化趋势（图1）.

    2.2模拟失重对大鼠乳鼠颅骨成骨细胞整合素亚单位蛋白表达的影响从模拟失重24 h开始，整合素α5, αv和β1亚单位的蛋白即发生改变，与对照组相比，α5的蛋白表达在模拟失重的24，48和72 h分别下降了13.1%, 20.3%和11.9%，差异均有统计学意义（P<0.05）. αv的蛋白表达在模拟失重的24, 48和72 h分别下降了7.4%, 18.2%和25.2%，差异均有统计学意义（P<0.05）. β1的蛋白表达在模拟失重的24，48和72 h分别下降了18.6%, 25.9%和27.5%，差异均有统计学意义（P<0.05）. 三种蛋白表达随模拟失重时间的延长均呈现逐步增加的变化趋势（图2）.

    3讨论

    整合素是一类重要的细胞表面受体家族，主要介导细胞与细胞外基质（ECM）的粘附，使细胞得以附着而形成整体. 整合素可将细胞外基质分子（如纤粘连蛋白、胶原等）与细胞内的骨架蛋白连接起来形成焦点粘附物，许多信号蛋白通过与焦点粘附物结合，调节着细胞的多种功能（包括细胞凋亡、细胞增殖、细胞粘附与迁移等）［3-4］. 由一个α亚单位和一个β亚单位非共价结合构成的异二聚体跨膜糖蛋白超家族. 至少15种α亚单位和9种β亚单位经不同组合产生二十多种整合素，不同类型的细胞可选择性表达某些整合素而改变其粘附特性. α, β亚单位都由较长的胞外区、单个跨膜区和通常较短的胞内区三部分组成. 胞外区能与细胞外基质(ECM)大分子结合，使细胞粘附于ECM；胞内区则与细胞骨架相互作用，将大量研究证实失重或模拟失重环境下骨骼的力学信号传导途径受到抑制，其中一条重要的途径为跨膜整合素、细胞骨架和细胞核转录功能之间的直接联系. Schneider等［7］将α5, β1整合素的抗体加入培养的UMR10601成骨细胞中，发现骨的矿化率分别下降了20%和45%；加入整合素α2β1抗体，骨的矿化率下降95%；去除抗体以后骨的矿化率又能恢复正常. Nesti等［8］的研究表明TGFβ1这种促成骨作用是通过整合素来实现的. 杨志明等［9］的实验结果发现阻断I型胶原－整合素α2β1系统后，成骨细胞增殖能力减弱，凋亡率增高，I型胶原，整合素α2, β1及骨钙素的mRNA表达减少.

    以上的实验结果提示整合素在调节成骨细胞作用. 我们的实验结果提示失重环境下整合素发生的下调性改变可能是引起骨质疏松的原因之一.

    【】

    ［1］   Holick MF. Microgravityinduced bone losswill it limit human space exploration ［J］? The Lancet, 2000,355(9215):1569-1570.

    ［2］   Zhang S, Wu XY, Li YH, et al. Effects of simulated weightlessness on the release of PGE2 in rat calvarial osteoblasts induced by flow shear stress ［J］. Space Med  Med Engin, 2001,14(4):235-239.

    ［3］   CavalcantiAdam EA, Tomakidi P, Bezler M, et al. Geometric organization of the extracellular matrix in the control of integrinmediated adhesion and cell function in osteoblasts ［J］. Prog Orthod, 2005,6(2):232-237.

    ［4］   Brakebusch C, Fassler R. Beta1 integrin vivo: Adhesion, migration and more［J］. Cancer Metastasis Rev, 2005,24(3):403-411.

    ［5］   Eble JA. Collagenbinding integrins as pharmaceutical targets［J］. Curr Pharm Des, 2005,11(7):867-880.

    ［6］   Berman AE, Kozlova NI, Morozevich GE. Integrins: structure and signaling［J］. Biochemistry, 2003,68(12):1284-1299.

    ［7］   Schneider GB, Zaharias R, Stanford C. Osteoblast integrin adhesion and signaling regulate mineralization ［J］. J Dent Res, 2001,80(6):1540-1544.

    ［8］   Nesti LJ, Caterson EJ, Wang M, et al. TGFβ1 stimulated osteoblasts require intracellular calcium signaling for enhanced integrinα5 expression［J］. Ann. N. Y. Acad. Sci, 2002,961:178-182.

    ［9］   杨志明，余希杰，屈艺，等. Ⅰ型胶原－整合素α2β1系统对成骨细胞生物学特性的调控［J］. 华西医科大学学报，2000,30(3):281-284.