CEA实时荧光定量RT

              作者：葛明建,时德吴庆琛,王梅,李强,李良彬

【关键词】  胞肺癌患

    【Abstract】  AIM: To assess whether surgical manoeuvre or resection of lung cancer could lead to haematogenous dissemination of malignant cells, to monito the quantity and timing of the shedding of lung cancer cells into the circulation of patients by fqRTPCR before, during and after surgery, and to determine the relationship between the sequence of vessel ligation and the haematogenous dissemination of cancer cells during operation. METHODS:  Sixtynine peripheral blood samples were collected 1 d before operation, during operation and 7 d after operation from 23 consecutive patients with nonsmall cell lung cancer who underwent surgical resection with curative intention. All patients were randomly assigned before the operation to 2 surgical procedure groups according to the order of vessel ligation (PVfirst group and PAfirst group). Additionally,  10 patients with benign lung disease served as control subjects undergoing surgical resection. All the peripheral blood samples were subjected to fqRTPCR with carcinoembryonic antigen as marker. RESULTS: The level of CEA mRNA in peripheral blood (PB) ascended continuously within this period. The postoperative value (D7) was significantly higher than that of preoperation (D-1) (P=0.000) and that of operative day （D0） (P=0.000). There was a striking difference between adenocarcinoma and squamous carcinoma (P=0.0375). The values of CEA mRNA in PB between PVfirst group and PAfirst group were significantly different (P=0.045). At the same time, there was a correlation between preoperative Tstage and perioperative CEA mRNA in PB (P=0.025). Among the 23 cases, 10 cases were positive (43.5%). Both the control subjects and the volunteers were negative. CONCLUSION：A considerable proportion of patients who appear to have resectable nonsmall cell lung cancer might be regarded as having systemic disease, which is often undetectable by current tumour staging method. CEAexpressing tumour cells are disseminated mostly postoperatively, which may potentially be the source of recurrence or metastases. Surgical manipulation can promote the release of tumour cells into the blood stream, but the ligation of PV before the ligation of the PA may partly prevent such release during surgery.

    【Keywords】 lung neoplasm; blood; polymerase chain reaction; carcinoembryonic antigen; messenger RNA; perioperative period

    【摘要】 目的：评价手术操作促进肺癌细胞入血的可能性，分析围手术期外周循环癌细胞（CTCs）的变化与常见临床病理指标间的关系. 方法：接受根治性手术的原发性非小细胞肺癌（NSCLC）患者23例，按预定的结扎血管顺序术前将病例任意分为先结扎肺静脉组和先结扎肺动脉组. 分别采集其术前1 d、术中及术后第7日外周血标本. 选择10例需手术的肺部良性疾病患者作为对照. 以20例健康人作为阴性对照. 以癌胚抗原（CEA）作为检测标志物，运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(fqRTPCR)法定量检测患者CTCs的存在状况. 结果：围手术期外周血CEA mRNA浓度变化呈上升趋势,术后第7日显著高于术前1 d(P=0.000)及手术当天(P=0.000). 肺腺癌术前CEA mRNA明显高于肺鳞癌（P=0.0375）. 先结扎肺静脉组与先结扎肺动脉组比较存在明显差异(P=0.045). 术前T分期与围手术期CEA测值间亦存在密切关系（P=0.025）. 术前阳性率为43.5%（10/23），而手术对照组及健康组均为阴性. 结论：可手术切除的NSCLC患者手术前就可能存在全身癌细胞的播散. 肺癌细胞主要在术后逐渐释放入外周循环. 外科手术操作可促使癌细胞术中入血，若先结扎肺静脉可一定程度阻止癌细胞释放.

    【关键词】 肺肿瘤；血液；聚合酶链反应；癌胚抗原；信使RNA；围手术期

       0引言

    肺癌手术中在结扎肺动脉以前结扎肺静脉可能是防止术中肺癌细胞被挤入血的有效方法［1］. 本实验中，我们以癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作为检测标志物，运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（fluorescent quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction，fqRTPCR）法定量检测了术前、术中及术后原发性非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)患者外周血中癌细胞的存在状况，以评价手术操作促进癌细胞入血的可能性，同时分析了围手术期外周循环癌细胞（circulating tumor cells，CTCs）的变化与常见临床病理指标间的关系.

    1材料和方法

    1.1材料本组病例包括接受根治性手术的23例原发性NSCLC患者，分别采集术前、术中及术后外周血标本共69份. 术前标本在手术前1 d采集，术中标本则在肺癌被切除以后采集，术后标本在术后7 d获取. 所有病例均经病诊断证实.  所有病例术前均未接受过化疗、放疗等治疗措施. 各病例临床病理特征见表1. 以10例需接受手术治疗的肺部良性疾病患者作为手术对照. 以20例健康人的外周血标本作为阴性对照.

    按预定的结扎血管顺序术前将病例任意分为先结扎肺静脉组（PVfirst Group）和先结扎肺动脉组（PAfirst Group）. 所有的手术操作均由同一外科小组完成. 术中进入胸腔以后，首先完成肺血管的游离和结扎，肺叶切除完成以后随之清除纵隔淋巴结. 术后除1例因呼吸衰竭死亡外，其余患者均无并发症发生.

    1.2方法

    1.2.1提取RNA首先运用人淋巴细胞分离液（上海化学试剂二厂）分离外周血单个核细胞（PBMNs）. 按Trizol Reagent (Invitrogen,Cat＃15596026)的说明提取PBMNs 中的总RNA. 通过测定A260 nmRNA的浓度，A260 nm/A280 nm的值判定RNA纯度，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测其完整性.

    1.2.2合成CDNA总RNA在70℃中孵育5 min. 逆转录反应在18 μL 1×RT缓冲液［50 mmol/L TrisHCl (pH 8.3), 75 mmol/L KCl及3 mmol/L MgCl2］中完成, 同时加入0.5 mmol/L dNTP, 1 μL RNasin及200 U MMLV逆转录酶(Promega), 合成条件为37℃ 30 min.

    1.2.3引物与探针用Primer Express软件(PE Applied Biosystems)设计Taqman引物和探针. CEA的引物序列为: 上游引物(5′→3′) GCCTTGACAAAACGTTCCTGG; 下游引物(5′→3′) GAACGG CGTGGATTCAATAGTG. CEA探针序列(5′→3′)： AGTCTCCCTCGGCCGCTCCCCA. 产物长度为199 bp（s）.表1原发性非小细胞肺癌患者23例的临床病理特征

    1.2.4Taqman PCR反应PCR反应在以下反应体系中完成:43 μL PCR反应缓冲液［10 mmol/L TrisHCl (pH 8.4), 50 mmol/L KCl及1.5 mmol/L MgCl2］, 0.2 mmol/L dNTP, 5 μL CDNA, 2 U Taq DNA聚合酶（Promega），上、下游引物各0.4 μmol/L，首先在95℃水平预变性5 min，然后按以下反应条件完成35个循环：95℃ 30 s，62℃ 20 s，72℃ 20 s. 最后在72℃下延伸10 min结束反应. 在每一批PCR反应中设立阳性对照（提自LC5细胞的RNA）及阴性对照（水）.

    根据所获得的标准曲线，得到各检测标本的起始浓度（基因拷贝数/毫升）. 实验数据均以每毫升血清中CEAmRNA拷贝数的常用对数表示. 所有反应均在ABI Prism 7000序列检测系统（PerkinElmer Applied Biosystem）中完成. 运用检测系统自带的软件计算Ct值并确定每个标本的起始拷贝数.

    1.2.5LC5细胞连续稀释试验用TrypsinEDTA（Sigma）收集单层培养的LC5细胞(一种肺鳞癌细胞株)，用冷PBS洗涤并混悬. 用计数池测定细胞的密度，以台盼蓝（Sigma）染色评价细胞的活力. 调整细胞的密度至2 mL DEPC处理水中含106个细胞. 为了模仿肺癌患者外周循环中癌细胞存在的情况，分别从健康志愿者外周血107个PBMNs和106个LC5细胞中提取RNA，将提取自正常人106个PBMNs中的RNA分别与提取自1，10，102，103，104和105个LC5细胞的RNA相混合. 阴性对照，则只以提自106个PBMNs的RNA为检测对象. 运用fqRTPCR法分别检测以上RNA混合物的起始基因拷贝数，并以此建立标准曲线和受试者工作特征（receiver operator charicteristic,ROC）曲线. 每个浓度的标本均重复测定3次.

    统计学处理： 用SPSS 10.0统计软件包建立数据文件并进行统计学分析. 采用重复测量数据的方差分析评估围术期测值变化趋势及分组变量与测值的关系. P<0.05提示差异有统计学意义.

    2结果

    2.1CEA诊断实验的评估ROC曲线下面积为0.850 (95%CI: 0.709~0.991) (图1). 将健康对照组均值的95%可信区间的上限（X+1.96SD）作为诊断实验的分界值, 其值为4.6151. 在此分界值标准下，诊断实验的灵敏度为91%，特异度为87%. 通过比较批间和批内不同浓度标准品的Ct值来评估检测方法的重复性, 批间和批内Ct(cycle threshold)值的变异系数(CV)分别为5.4%和2.7%. 图2及图3(荧光定量PCR的扩增过程包括3个阶段：基线期、指数期及平台期. 当报告基团的荧光强度超过阈值时的循环数就是Ct值)分别显示标准曲线及扩增曲线.

    2.2围手术期CEA测值变化趋势围手术期外周血CEA mRNA浓度变化呈上升趋势,术后第7日显著高于术前1 d(4.87±0.18 vs 4.48±0.16, P=0.000)及手术当天(4.87±0.18 vs 4.54±0.25,P=0.000). 手术当天测值与术前1 d比较无显著差异.

    2.3术前CEA mRNA水平与组织类型间的关系肺腺癌患者(n=9)术前外周血中CEA mRNA明显高于肺鳞癌患者n=14（4.70±0.16 vs 4.34±0.54, t=1.873, P=0.0375, 组间t检验）. 采用组间t检验法分析术前外周血CEA mRNA浓度与患者性别、年龄、手术部位及pTNM分期等间的关系,差异无统计学意义（P＞0.05）.

    2.4围手术期外周血CEA mRNA水平与血管结扎顺序及T分期间的关系先结扎肺静脉组与先结扎肺动脉组比较围术期外周血CEA mRNA测值可能存在差异(4.40±0.32 vs 4.82±0.48, P=0.045). 术前T分期与围术期CEA测值间亦存在一定关系, T分期越晚,则CEA mRNA水平越高（4.27±0.28 vs 4.76±0.37, P=0.025）.

    2.5术前外周血CEA阳性率以健康对照组均值的95%可信区间的上限值为分界值, 若测值＞4.6151为阳性. 则术前23例患者中有10例为阳性,阳性率为43.5%.

    3讨论

    CEA被认为是一种肿瘤特异性的标志物，它在胚胎时期的结肠以及各种肿瘤组织中表达，并且与患者的预后呈负相关关系［2］. 不少研究者将其作为检测肺癌患者外周血CTCs的标志物［3-4］. 由于有些研究者发现CEA在正常组织亦有表达，因此目前CEA是否一定是属肿瘤特异性标志物尚存在争议［2］. Giesing等［5］则非常肯定地认为CEA属于肿瘤特异性的. 如今，基于mRNA基础上的癌细胞鉴别技术的主要局限性就在于大多数标志物的组织特异性不够. 在没有发现特异性很理想的标志物的前提下，要克服这一问题，只有建立定量检测的方法. 此时，存在于非肿瘤细胞内的低水平表达可被视为阈值（Threshold）［6］. 本实验我们是建立在这样一种假设基础上的，即CEA在正常组织中有表达，但与含有转移性肺癌的组织相比，它是微不足道的. 一旦它在外周血中的表达超过某一假定的水平，则提示有肿瘤细胞存在.

    由于传统的RTPCR法最多只能达到半定量的程度，因此它很难区分正常组织中靶基因的基础表达水平与癌相关组织中增高的表达水平，从而导致假阳性的产生. 我们以CEA作为检测标志物，运用fqRTPCR法来检测CTCs，以便为动态监测疾病、观察疗效及早期诊断等创造条件. 能够获得CTCs的定量信息是一个很大的进步. 与传统定量PCR相比，实时定量PCR具有自己独特的优点［7］. 这项技术还被运用于肿瘤患者骨髓和淋巴结中微转移的检测［8-10］. 该法的重要特征之一就是在PCR产物扩增过程中实时得出产物的量，这一点与终点检测法完全不同，后者是只有当反应完成预设循环数后才产物的累积数量. 靶基因的起始拷贝数越高，则反应过程中能被监测到的增高的荧光信号就越早. 通过测定Ct值就能够知道待测样品中靶基因的拷贝数，运用标准曲线可获得它的起始拷贝数. 为了区分阳性结果是由于存在CTCs还是正常PBMNs的低水平表达所致，我们将健康对照组实验结果均值的95%可信区间的上限值作为真阳性标准. 这样可对待测标本的标志物进行定量分析，可克服传统RTPCR的技术缺点及一定程度上解决标志物的非特异性问题.

    本研究结果表明，术前患者外周血CEA mRNA水平与NSCLC患者的组织类型间存在密切关系，提示肺癌的组织类型不同时，其生物学行为亦会有差异. 因此，在临床诊疗过程中，应区别对待不同的情形，即遵循“个体化”的原则，对于肺腺癌患者可给予术后全身性辅助治疗，以获得更好的疗效. 我们没有发现实验结果与癌肿的术后pTNM分期间存在相关性，这也一定程度上解释了为何有些病理分期属早期（Ⅰ/Ⅱ）的肺癌患者术后很早就出现远处转移的临床现象. 同时提示目前的pTNM分期系统尚不完善，可考虑将一些新的有价值的因素（如CTCs）纳入现行分期系统中.

    本组患者围手术期外周血CEA mRNA与T分期有密切关系. 癌肿越大，术后血行播散的癌细胞就越多. 推测其可能为癌肿体积越大，术中受机械压迫就越多，癌细胞入血就越多. Yamashita等［11］的研究也一定程度上支持本实验结果.

    23例患者中的10例术前CEA mRNA表达阳性，提示临床上认为可“根治性切除”的肺癌患者术前就存在CTCs. 临床观察发现，对呈明显“局限型”表现的原发瘤实施根治性切除后，仍有相当一部分患者术后出现远处转移，提示这部分患者可能术前就存在不能被目前常规检查手段发现的播散性癌细胞. 在癌肿生长的早期阶段，隐匿性癌细胞即可通过血行或淋巴途径扩散，而这一现象往往被现今的临床和病理分期手段所忽略. 虽然本实验方法不允许对肿瘤细胞进行特异性鉴定，但是实验结果还是提示有相当比例的可切除NSCLC患者中存在全身性癌细胞播散.

    术中癌细胞播散入血经常发生［12-13］. 本实验结果显示，肺血管结扎顺序与围手术期CEA mRNA表达细胞入血间存在较密切的关系（ＧPＧ=0.075,2sided）. 我们认为外科手术操作可促使术中和术后癌细胞入血，而术中先结扎肺静脉可能有助于减少癌细胞脱落入血.

    我们认为，作为一种诊断手段，检测微转移或CTCs使得实时监测肿瘤成为可能，并且可能对肿瘤的个体化治疗产生很大影响. 传统检测方法（如影像学方法）只能了解临床转移灶出现以后的情况，无法明确从原发瘤切除以后至转移形成以前这段时间的情况. 随着PCR等新的检测手段不断，微转移的检测可能填补存在于原发瘤与转移灶之间的这条鸿沟，从而提高肿瘤疗效.

    【】

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