虎杖苷对烧伤血清和LPS作用下大鼠平滑肌细胞蛋白激酶C活性的影响

            作者：王月刚，金春华，黄海潇，吴平生

【关键词】  虎杖苷

    基金项目：国家基金

    【Abstract】  AIM: To explore the mechanism of polydatin (PD) treating shock through studying the influence of PD on the activity of protein kinase C (PKC) of vascular smooth muscle cells (VSMC) when treated by sera from burned rats and lipopolysaccharide (LPS). METHODS: After VSMC was treated by sera from burned rats or LPS, the activity of PKC was measured by γscintillation counting instrument. RESULTS: Activity of PKC of VSMC cytoplasm after treated by sera from burned rats decreased (P<0.05 vs normal group), but activity of PKC of cell membrane increased (P<0.05 vs normal group). When VSMC was treated with PD, the activity of PKC of VSMC cytoplasm increased and that of cell membrane decreased (P<0.05 vs burned group and control group, P>0.05 vs normal group). However, the activity of PKC of VSMC cytoplasm and cell membrane treated by LPS increased (P<0.05 vs normal group), after PD treated VSMC the activity of PKC decreased again (P<0.05 vs LPS group and control group, P>0.05 vs normal group). CONCLUSION: PD antagonizes the damage effects of LPS and sera of burned rats by reversing the PKC activities, which  may be one of  the molecular mechanisms of PD antishock property.

    【Keywords】 burn; lipopolysaccharide;   smooth muscle cell;  polydatin;  protein kinase C

    【摘要】 目的:观察虎杖苷(PD)对烧伤血清和脂多糖（LPS）作用下大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨其抗休克的机制. 方法:取大鼠胸主动脉培养VSMC，用烧伤血清和LPS刺激VSMC后，γ闪烁计数仪测定PKC活性. 结果： 烧伤血清作用后VSMC胞质PKC的活性下降(vs正常组P<0.05)，但胞膜的PKC活性上升（vs正常组P<0.05），经PD后胞质PKC的活性上升（vs烧伤组、治疗对照组P<0.05，vs正常组P>0.05），胞膜的PKC活性下降（vs烧伤组、治疗对照组P<0.05, vs正常组P>0.05）.  LPS刺激后VSMC胞质与胞膜PKC的活性均上升（vs正常组P<0.05），经PD处理后其活性又均下降（vs LPS组、治疗对照组P<0.05，vs正常组P>0.05）. 结论： PD对烧伤血清和LPS作用下的VSMC的保护作用可能是通过调节PKC的活性来发挥作用的，这可能是其抗休克的分子机制之一.

    【关键词】 烧伤；脂多糖；平滑肌细胞；虎杖苷；蛋白激酶C

      0引言

    虎杖苷(polydatin, PD)是从中药虎杖中提取的主要成份，在体动物实验表明PD对烧伤性、感染性休克有良好疗效，治疗休克动物的存活时间和存活率均明显优于6542和多巴胺［1］. 平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)在小血管的收缩扩张中占据着主导地位，而蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性则对VSMC的收缩功能起着重要的调节作用［2］. 对于感染性休克来讲，细菌内毒素起了重要的作用，内毒素的主要成份为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此我们用LPS刺激大鼠SMC来模拟感染性休克，同时，我们也应用烧伤血清刺激SMC来模拟烧伤性休克，观察了PD在此种情况下对SMC PKC活性的影响，以探讨PD抗休克的作用机制.

    1材料和方法

    1.1材料清洁级SD大鼠，40只，体质量180～220 g，雌雄不拘，由南方医科大学实验动物中心提供. PD由校化学教研室提纯制备. LPS(浓度2.5 g/L)，磷脂酰丝胺酸（phosphatidylserine, PS）,组蛋白ⅢS型（histoneⅢ）,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）和Triton X100购自Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. γ32PATP, ATP(250 mmol/L), CaCl2, MgCl2, DTT, Hepes, 蔗糖，TrisHCl, EGTA,  EDTA, 乌拉坦, α氯醛糖等均为国产试剂. PD用DHanks液配制成2 mmol/L，避光保存. PS用氯仿配制成2 g/L，避光贮于-20℃. PMSF用异丙醇配制成100 mmol/L，-20℃保存. LS6500型液体闪烁计数仪（Bechman公司，测量PKC的活性），低温高速离心机（Bechman Avanti J25, 提取PKC用）.

    1.2方法

    1.2.1大鼠主动脉SMC的培养［3］将大鼠断头处死，无菌操作取一段胸主动脉［4］，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1 mm×1 mm大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4 h后翻转，于37℃ 50 mL/L CO2的细胞培养箱中静置3 d(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2 d换液. 一般4~7 d左右SMC从组织块中爬出，2~3 wk出现致密细胞层. 待细胞快融合时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取3~8代细胞做实验.

    1.2.2烧伤血清的制备成年SD大鼠30只，用133 g/L乌拉坦,5 g/L α氯醛糖麻醉，每100 g体质量0.6 mL剂量腹腔注射给药. 将SD大鼠固定在操作台上，颈动脉插管(插管预先用肝素抗凝)，然后将大鼠双下肢及髂前上棘以下的部分浸泡于80℃水中30 s，监测大鼠血压直到40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）. 当血压下降到40 mmHg时取大鼠全血，置于离心管中，静置30 min，然后3000 r，10 min，收集上清即为大鼠烧伤血清，一般一只大鼠可取2~3 mL烧伤血清.

    1.2.3PKC的提取和测量

    1.2.3.1缓冲液的配制缓冲液A：将预先配制的EGTA, EDTA, DTT, Hepes, PMSF分别加25,20,0.2,25,1.2 mL，然后加入5.1345 g蔗糖，定容至100 mL.  缓冲液B (mL)：将预先配制的Hepes 7.5, EDTA 12, EGTA 30, DTT 3混在一起，定容至60 mL. 以上两种缓冲液用时临时配制，贮存于4℃，使用期限1 wk.  层析柱的制作：称取纤维素（DE52）3 g，溶于10 mL三蒸水中，1 h后去除上层的细小颗粒，然后再次加入三蒸水10 mL，如此重复三次，将DE52的细小颗粒去除. 然后将纤维素装入1 cm×6 cm大小的层析柱，以备过滤时用. PKC的反应体系缓冲液：50 mmol TrisHCl (pH 7.5), 0.5 mmol CaCl2, 20 mmol MgCl2, 20 mg/L磷脂酰丝氨酸，50 mg/L组蛋白H1（ШS型），1 mmol/L DTT, 50 mmol/L ATP, 5 mmol/L (γ32P)ATP.

    1.2.3.2提取和测量取培养3~8代的SMC，先用PBS离心冲洗两次，再用细胞刮子轻轻刮下细胞，在冰冷状态下置于低渗的缓冲液B中膨胀15 min（置于冰壶中）. 超声粉碎仪粉碎细胞，一般35焦能量，打10次即可破碎细胞. 4℃下30 000 g，1 h，上清液即为PKC细胞质的提取物. 所得沉淀为胞膜，将含有5 mL/L Triton X100的缓冲液A加入其中，在冰壶中孵育30 min，4℃ 12 000 g，10 min，所得上清液为细胞膜的粗提物. 然后用缓冲液B（容量为层析柱的容量）平衡DE52层析柱，将PKC提取物置于DE52层析柱上. 首先用12倍于层析柱体积的缓冲液B洗涤，继以等层析柱容量的含有0.05，0.10，0.20 mol/L NaCl溶液洗脱，把通过紫外分析仪波峰时的洗脱液收集起来即为PKC的提取物. 贮存于-20℃以备检测. 将PKC提取物加入反应体系缓冲液中，置于30℃水中温浴30 min，每管中加入50 μL三氯乙酸终止反应. 终止后的反应体系加在硝基纤维素膜，负压吸引器下用3 mL三氯乙酸溶液洗涤3次，滤膜放入液闪瓶中进行闪烁计数得出CPM值，然后通过公式出PKC的活性.

    1.3分组实验分两部分，一部分为烧伤血清刺激，一部分为LPS刺激，n=5. 烧伤血清刺激分正常组（不加任何处理因素），烧伤组（大鼠烧伤血清刺激1 h，血清浓度为200 mL/L），组（在烧伤组处理完毕后加PD治疗2 h，PD终浓度为0.4 mmol/L），治疗对照组（在烧伤组处理完毕后加与PD等量的DHanks，作用2 h）；LPS刺激分正常组（未做任何处理），LPS刺激组（加入LPS使其终浓度为100 μg/L，刺激30 min），治疗组（在LPS刺激组基础上加PD，终浓度为0.4 mmol/L，作用2 h），治疗对照组（在LPS刺激组基础上加与PD等量的DHanks，作用2 h）.

    统计学处理： 结果用x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析.

    2结果

    2.1PD对烧伤血清刺激后SMC胞质及胞膜PKC的影响胞质：烧伤组的PKC活性比先前有所下降，与正常组比较P<0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所上升，与烧伤组比较P<0.05，与正常组相比P>0.05. 而治疗对照组的活性上升更高, 与烧伤组和治疗组比较P<0.05. 胞膜：烧伤可以使胞膜PKC的活性上升，P<0.05. 而经PD治疗后PKC的活性有所恢复，与烧伤组相比较P<0.05. 而治疗对照组的PKC活性与治疗组相比较P<0.05，与烧伤组比较P>0.05(表1).

    2.2PD对LPS刺激下SMC胞质及胞膜PKC活性的影响胞质：LPS刺激后细胞胞质PKC的活性升高，与正常组相比P<0.05. 经PD治疗后PKC活性有下降，与LPS刺激组相比P<0.05，而治疗对照组PKC活性没有恢复. 胞膜：SMC胞膜PKC的活性也上升，与正常组相比P<0.05. 经PD治疗后PKC的活性有所下降，与LPS刺激组相比P<0.05. 不同的是治疗对照组的PKC活性下降更明显，与治疗组和正常组相比P值均<0.01(表1).表1虎杖苷(PD)对烧伤血清及脂多糖（LPS）刺激下大鼠平滑肌细胞(SMC)蛋白激酶C活性的影响

    3讨论

    本实验中，烧伤血清刺激VSMC 2 h后, 胞质的PKC活性下降，胞膜PKC的活性上升，表明烧伤血清的作用主要是促进PKC的激活转位. 而PD处理则减低了胞膜PKC的活性，升高了胞质中PKC活性. 表明PD可对抗烧伤血清引起的PKC异常变化. 实验中我们还发现治疗对照组的胞质PKC活性升高很多. 其原因可能为，治疗对照组是在烧伤血清的基础上加DHanks液，并没有去除烧伤血清，使烧伤血清的刺激作用长期存在，导致大量脂质氧化物质的产生，这些物质可以显著减慢DAG的降解［2,5］，从而持续不断的激活PKC，使胞质中PKC的活性持续升高，提示PD对烧伤治疗的机制可能与其调节PKC的活性有关. 它通过维持PKC活性的稳定来减轻机体的损伤.

    在感染性休克发生过程中，LPS是主要的致病因素. 从本实验结果来看，LPS刺激VSMC后，细胞胞质和胞膜的PKC活性均升高，表明LPS引起的损伤效应至少有部分是通过PKC信号系统介导的. 其激活PKC的机制可能有以下几方面［6］：LPS能直接引起肌醇磷脂分解产生DAG，从而激活PKC；同时LPS与十四佛波乙酸酯相似，有可能以佛波酯类物质的方式直接激活PKC；此外，它还可以使机体释放大量血管紧张素Ⅱ、儿茶酚胺等因子，这些因子也能引起细胞膜肌醇磷脂分解产生DAG，进一步激活PKC.

    LPS损伤的VSMC给予0.4 mmol/L PD作用后，细胞质和细胞膜PKC的活性均减低. 提示PD可能是通过影响PKC的活性来对抗LPS的损害作用，但是PD是通过什么机制调节PKC的活性还不太清楚. 对于治疗对照组，其胞质的PKC活性与LPS组相比没有太大变化，而胞膜的PKC活性降低较显著，这可能是由于PKC的耗竭机制和自我反馈机制而导致. 由于LPS的刺激在对照组并没有去除，其持续刺激一方面导致PKC的大量消耗，到后期没有足够的PKC从胞质转位到胞膜上，另外一个方面可能是由于PKC活性的升高反馈性的抑制了胞膜PKC的活性，从而降低了胞膜PKC的活性［5］.

    但是与烧伤损伤不同的是，LPS激活后的PKC并没有使平滑肌的收缩性增强，反而使其收缩性下降［5］. 这可能是由于LPS激活的PKC同工酶与其它损伤所激活的同工酶不同，进而导致其作用底物不同而致. PKC的同工酶不少于12种，其中cPKC包括PKCα,βⅡ和γ，而nPKC则包括PKCδ，ε和ζ. 在LPS刺激SMC时，主要是PKCα，ε和ζ被激活. PKC的磷酸化使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活化，iNOS的增加导致了NO的大量合成，NO为强烈的舒血管因子，可以使血管强烈扩张. 由于LPS持续的刺激，PKC被持续激活，iNOS也就大量产生，使NO在胞内的含量增加，从而导致了SMC收缩性的下降.

    【】

    ［1］ 黄巧冰，赵克森，黄绪亮. 虎杖4号与多巴胺、6542治疗大鼠失血性休克疗效的比较［J］. 微循环学杂志， 1995, (1): 7-9.

    ［2］ Begum N, Duddy N, Sandu O, et al. Regulation of myosinbound protein phosphatase by insulin in vascular smooth muscle cells: Evaluation of the role of rho kinase and phosphatidylinositol3kinasedependent signaling pathways［J］. Mol Endocrinol, 2000, 14(9):1365-1376.

    ［3］ 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术［M］. 北京:北京出版社, 1995: 131.

    ［4］ Pease DC,  Paule WJ. Electron microscopy of elastic arteries; the thoracic aorta of the rat［J］. J Ultrastruct Res, 1960, 3: 469-483.

    ［5］ Ha H, Yu MR, Choi YJ, et al. Activation of protein kinase cdelat and cepsilon by oxidative stress in early diabetic rat kidney［J］. Am J Kidney Dis, 2001,38(suppl 1):S204-S207.

    ［6］ Hassan F, Islam S, Koide N, et al. Role of p38 mitogenactivated protein kinase (MAPK) for vacuole formation in lipopolysaccharide(LPS)stimulated macrophages［J］. Microbiol Immunol, 2004,48(11):807-815.