菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察

          作者：陈小伍，方驰华，刘胜军，崔冰，王岩，黄治荣

【关键词】  骨髓基质干细胞；菲立磁；磁共振成像；干细胞移植

     【Abstract】 AIM： To study the method of tracking of allogenically grafted rat bone marrow stem cells （BMSCs） labeled with Feridex in rat liver. METHODS：Feridex was used to label isolated BMSCs. Labeled BMSCs were examined by Prussian blue staining and electron microscopy. Successfully labeled BMSCs (2.0 mL，1×109/L) were respectively transplanted through portal vein, local liver parenchyma and caudal vein of the SD rats. Six hours before transplantation and 6 h, 1, 3, and 5 weeks after transplantation, magnetic resonance imaging (MRI) examination (the sequences used were SET2WI, FSET2WI, GRET2WI) was conducted on rat livers. RESULTS： Prussian blue staining confirmed the labeling efficiency was above 90%,  and transmission electron microscopy showed numerous iron particles in the cytoplasm of Feridexlabeled BMSCs. MRI (SET2WI) showed: no remarkable low signal change was found in the liver images before transplantation of all 3 groups. In the porta hepatis of portal vein transplantation group remarkable low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1 and 3 weeks after transplantation, while the low signal change could not be seen 5 weeks after transplantation. In the section where the cells were injected in of liver topical transplantation group remarkable low signal changes were seen 6 h after transplantation and the extent gradually expanded 1, 3 and 5 weeks after transplantation. No remarkable low signal change was found in the liver images of caudal vein transplantation group at all time points after transplantation. CONCLUSION： Allogenically grafted Feridexlabeled BMSCs can be tracked effectively in rat liver by MRI.

    【Keywords】 bone marrow stem cells；Feridex；magnetic resonance imaging；stem cell transplantation

    【摘要】 目的：研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法. 方法： 采用菲立磁（Feridex）对分离培养的BMSCs进行标记，Prussian blue染色和电镜观察对标记后的BMSCs进行鉴定；取鉴定后的BMSCs 2 mL（1×109/L）分别注射到SD异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内；采用磁共振成像(MRI)技术（SET2WI，FSET2WI，GRET2WI序列）分别对移植前6 h,移植后6 h，1，3和5 wk时的大鼠肝脏进行扫描. 结果：Prussian blue染色证实Feridex标记BMSCs阳性率>90％，透射电镜见铁颗粒位于BMSCs胞质中；MRI扫描 SET2WI序列成像显示：各移植组在移植前肝脏均未见异常低信号区；门静脉组大鼠移植后6 h在肝门部可见异常的低信号改变，1，3 wk低信号改变范围逐渐扩大，第5周时低信号改变消失；肝内注射组大鼠移植后6 h在肝脏局部注入区域可见异常的低信号改变，1，3，5 wk低信号改变区域逐渐扩大. 尾静脉组在移植后各时间点均未见到异常低信号改变. 结论：Feridex标记的大鼠BMSCs在同种异体移植鼠肝脏中可用MRI进行有效的追踪.

    【关键词】 骨髓基质干细胞；菲立磁；磁共振成像；干细胞移植

      0引言

    国内外研究［1-2］表明，骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）在一定的条件下，可分化为有功能的肝细胞，且获取及体外培养容易，没有伦理道德的争议，可以作为种子细胞来急慢性肝功能衰竭和修复肝脏损伤，具有极大的研究价值. 但同种异体移植后BMSCs在活体肝内的定居、迁移和分化机制尚不清楚. 我们利用直径为纳米级别的超顺磁性氧化铁粒子菲立磁（feridex）对大鼠BMSCs进行标记，并利用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术对多种途径同种异体移植的BMSCs在大鼠肝内进行了定位与追踪.

    1材料和方法

    1.1材料SD清洁级大鼠（80～100 g，2只，供提取骨髓用；200～220 g，雄性36只，供同种异体细胞移植用）购自广州军区广州总动物实验室. Feridex购自美国泛华医药公司. DMEM（低糖）培养基购自美国GIBCO公司；优质胎牛血清购自奥地利PAA公司；胰蛋白酶购自AMERSCO公司；其他化学试剂为国产分析纯. Olympus相差显微镜，HERAEUS超净台，FORUM CO2培养箱，东芝1.5T超导MRI机（型号Exelart/P3）.

    1.2方法

    1.2.1BMSCs分离、培养、鉴定及传代percoll梯度离心法(连续密度梯度离心分离法)分离纯化大鼠BMSCs. 采用密度为1.073 kg/L的Percoll液分离骨髓液，离心后BMSCs将聚积在第二层. 完整取大鼠双后肢股骨，DHanks液吹吸骨髓. 抗凝骨髓经低糖的DMEM培养基稀释. 将比重为1.073 kg/L的Percoll置试管底部，按照1∶1的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，900 g/min离心30 min. 收获分离的单个核细胞，DMEM洗两次，接种于24孔板内，各孔内加入100 mL/L胎牛血清，48 h后除去非贴壁细胞，更换新鲜培养液，50 mL/L CO2，37℃和饱和湿度的条件下培养，待细胞生长至瓶底90%融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化，传代培养. 收集第4代BMSCs，流式细胞仪检测CD29，CD44，CD45等表面标志、成骨诱导后行细胞碱性磷酸酶染色. 具体方法参照［3］.

    1.2.2Feridex标记BMSCs的制备取第3代对数生长期的BMSCs，消化后机械吹打成单细胞，以约5×108/L的密度接种到含有不同浓度Feridex的200 mL/L胎牛血清培养基(低糖DMEM)中孵育. 标记培养基中Fe3+浓度为16.8 mg/L. 50 mL/L CO2，37℃培养48 h. 2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS重悬，计数后备用. Prussian blue染色及透射电镜鉴定铁颗粒是否被吞噬进细胞.

    1.2.3Feridex标记BMSCs大鼠同种异体移植及MRI追踪细胞移植：36只SD大鼠同室同条件饲养. 设门静脉组、肝内注射组、尾静脉组，每组6只，并每组设6只为对照. 经10 mg/L水合氯醛（1 mg/kg体质量）腹腔麻醉后固定，①门静脉组、肝内组：消毒腹部皮肤，分层进入腹腔，暴露肝脏，显露肝门部，解剖门静脉. 门静脉注射组用微量注射器在15 min内向门静脉缓慢注入细胞悬液2 mL（含BMSCs 1.0×109/L），留针10 min，拔针后局部按压止血；肝内注射组直接向肝尾状叶下半部内注入同等剂量的细胞悬液2 mL，方法同上. 见无明显渗血后，300 mg/L双氧水冲洗术区；逐层关闭腹腔，碘伏消毒皮肤切口. 术后给予庆大霉素1×104 U，1次/d腹腔注射，持续7 d，单笼饲养.  ②尾静脉组：穿刺前先将尾部放在45℃～50℃温水中浸润0.5 min,乙醇擦拭，小针穿刺，见回血后，在15 min内缓慢注入标记后的BMSCs悬液2 mL（含BMSCs 1.0×109/L或2.0×109/L或3.0×109/L），对照大鼠注入未标记的BMSCs悬液2 mL. 留针10 min，拔针后局部按压止血.

    1.2.4MRI检查所使用的MRI机为1.5T场强. 为保证大鼠肝脏信号有效显示，采用小型相控阵线圈采集和接受信号（本实验使用膝关节线圈检查）,并在每次扫描前进行匀场. 检查时同前方法麻醉后俯卧位固定于有机玻璃板上，并置于线圈中央. 扫描序列为SE T2WI, FSET2WI, GRET2WI，并对图像的清晰度、对比度、解剖形态等各方面进行综合对比，以选定最佳的成像序列进行扫描分析. 扫描主要参数为：TR=4900 ms，TE=100 ms，翻转角为90/160，2次采集，层厚3 mm. 扫描前采用三轴定位图预设扫描视野（FOV），以适应大鼠的体型，保证有较好的信噪比. 分别于移植术前6 h、移植术后6 h，1，3和5 wk对大鼠肝脏行MRI检查.

    1.2.5组织学检查MRI检查后解剖大鼠肝脏，观察肝脏组织，并取肝组织（肝内组取肝尾状叶下半部、门静脉组和尾静脉组取肝门部及各肝叶部位）行4 μm冰冻连续冠状切片，最后行Prussian blue染色和核固红复染.

    2结果

    2.1BMSCs培养与鉴定原代细胞接种后24 h内，单个核细胞贴壁，48 h可见部分贴壁细胞开始分裂增生，细胞形态为多角形、梭形或纺锤形. 未贴壁细胞随换液而逐步消除. 1 wk后贴壁细胞体积增大，有长杆状、三角形、多边形细胞等. 形成多个细胞集落，大小不一，呈旋涡状. 原代细胞生长至90％左右时传代. 传代后细胞增长速度加快，平均5 d左右传代. 第3代~第5代细胞生长状态较好. 第6代开始细胞增长速度变慢，细胞生长状态亦变差. 第3代BMSCs行流式细胞仪检测，结果：CD29+/CD44+/CD45-，且细胞纯度较高. 成骨诱导2 wk后细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性.

    2.2Feridex标记BMSCs的Prussian blue染色细胞贴壁良好，Prussian blue染色见90％以上BMSCs胞质内含有蓝色颗粒，即铁颗粒(图1).

    2.3标记后BMSCs的透射电镜观察可见铁颗粒位于BMSCs胞质中(图2).

    2.4BMSCs移植前后MRI扫描经过对三种T2WI序列肝脏扫描图像的对比分析，以SET2WI序列成像最佳，因此采用SET2WI序列对大鼠肝脏进行MRI扫描并进行图像分析. 各移植组在移植术前肝脏实质均未见异常低信号区，可以清晰显示正常门静脉树的流空信号影（低至无信号区）以及正常胆道树高信号影. 移植后大鼠肝脏扫描：①门静脉组：移植后6 h在肝门部可见异常的低信号改变，移植后1，3 wk低信号改变范围逐渐扩大，移植后第5周时低信号改变未能发现，对照组肝脏在各时间点均未见异常低信号改变； ②肝内组：移植后6 h在局部注入区域可见异常的低信号改变，移植术后1，3和5 wk低信号改变区域逐渐扩大，对照组肝脏未见异常低信号改变；③尾静脉组：移植标记后的BMSCs悬液浓度为 1.0×109/L时，大鼠肝脏与对照组比较未见异常低信号改变. 调整标记后的BMSCs悬液浓度为2.0×109/L及3.0×109/L后，实验组与对照组在各时间点比较肝脏仍未能见到异常低信号改变.

      2.5组织学检查①门静脉组：实验组移植后肝门部可见聚积的呈蓝色染色的铁颗粒细胞，各时间点组织学改变基本与MRI影像对应（图3）. 对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.  ②肝内组：实验组移植后肝尾状叶下半部切片可见许多细胞质呈蓝色染色的铁颗粒细胞，各时间点组织学改变基本与MRI影像对应（图4）. 对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.  ③尾静脉组：实验组移植后各时间点与对照组比较，肝内可见少量分散的呈蓝色染色的铁颗粒细胞. 对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.

     3讨论

    目前广泛应用的几种细胞标记技术，如BrdU法［4］,DAPI法［5］, PKH26法［6］,GFP法［7］,Y染色体标记法［8］等，各有其优缺点，但均需行组织切片，对实验对象有创伤性，多需处死实验对象. 这些方法既不利于在同一个体内连续、动态的跟踪观察，也不可能应用于人体. Feridex可以在体外标记细胞并利用MRI技术在活体动态、无创地追踪移植的细胞. 它是一种超顺磁性纳米颗粒，利用其磁顺应性，可以在外加磁场的作用下引起足够强度的MRI信号的改变而追踪被标记物在活体内的迁徙、分化等. 它可通过非特异性膜表面吸收过程进入细胞内，包括人类的神经干细胞和间质干细胞等，在合适的浓度标记时被标记细胞的增殖、分化能力不受影响.  国内外众多家［9-12］已应用此方法标记细胞同种异体移植入脑内的定位、追踪等. 至于利用MRI追踪同种异体移植鼠肝脏中的Feridex标记的大鼠骨髓基质干细胞，目前未见报道. 我们对此进行了初步研究，观察了多种途径同种异体移植的Feridex标记细胞在肝内的定位和随时间的变化情况，以期为此标记技术应用于肝脏疾病的研究提供实验依据.

    本实验我们采用SET2WI序列对大鼠肝脏进行MRI扫描并进行图像分析. 由于Feridex是一种含铁的MRI造影剂，能够影响其周围的微磁场环境，造成对局部微磁场环境十分敏感的T2时间缩短，采集时局部呈异常低信号改变，所以SET2WI序列也是MRI有效的观察Feridex在局部组织内浓聚的序列. 各移植组在移植术前肝脏均未见异常低信号区. 移植后大鼠肝脏扫描，门静脉组结果提示门静脉移植的细胞可透过血管壁进入肝实质，随着时间的增加，磁性粒子分散，到第5周时密度不足以引起足够的MRI影像改变而不能继续追踪. 肝内组MRI结果考虑局部注射的BMSCs可随时间的改变而增殖或迁移. 尾静脉组虽加大移植细胞浓度和数量，实验组大鼠与对照组比较肝脏仍未能发现异常低信号改变. 肝组织切片见少量分散的呈蓝色染色的铁颗粒细胞，考虑经外周静脉移植细胞入血后被大量破坏或分散到其它组织器官，进入肝脏的细胞亦分散至肝脏各叶，不能产生足够的磁顺应性而引起MRI图像的改变.

    综合分析3种途径移植的BMSCs的MRI追踪结果，可得出以下初步结论：① 移植细胞达到一定的量方能引起有效的MRI影像改变. 外周静脉移植未能见到异常的肝脏MRI低密度影改变，考虑为进入肝脏的细胞（或Fe3+）密度不够. 另外，门脉移植后6 h，1 wk，3 wk时可见到异常低密度影像改变，到5 wk时未能继续见到，考虑随着移植细胞的增殖、分裂或迁移导致Fe3+密度降低所致. ②移植途径影响追踪效果：外周静脉移植的BMSCs虽提高移植细胞浓度仍未能有效追踪；门静脉移植的细胞移植后3 wk内可见到影像改变，但5 wk后未能继续追踪；肝内直接注射移植的细胞在移植5 wk后仍可继续追踪. 提示肝内直接注射因细胞无需透过血管壁（门静脉途径）或在外周血管长途迁徙受到损害（尾静脉途径）而最为有效，这为移植途径的选择提供了. ③Feridex标记的大鼠BMSCs在同种异体移植鼠肝脏中的MRI追踪存在的问题：①MRI影像的判断：相对于脑实质而言，肝脏肝门部血管粗大，胆管分布复杂，且毗邻胃肠道等空腔脏器. 血管流空、空气的低密度影像干扰对标记细胞的图像会产生较大的干扰. 目前对Feridex标记BMSCs门静脉或肝脏局部移植的MRI影像判断还主要依靠同一肝脏移植前后同一层面影像的对比，并需高年资MRI医师的协助. 如何降低移植细胞影像的判断难度、减少血管流空、空腔脏器影像的干扰，还需在进一步的移植实验中摸索. ②小的低密度影像改变的追踪：目前MRI仪的扫描厚度较大，容易遗漏较小的影像变化，相信随着MRI技术的进步，有望追踪到移植细胞更小的影像变化. ③Fe3+对肝细胞的毒性：引起足够的MRI影像改变需足够的Fe3+浓度，但高浓度的Fe3+对细胞是有害的. 虽部分研究者［9-10］认为目前细胞标记所应用的Fe3+浓度不足以对正常细胞产生影响，我们也未观察到标记细胞周围正常肝细胞有明显的毒性反应，但此影响仍有待于进一步观察和研究.

    【参考】

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