骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记
【关键词】 骨髓
【Abstract】 AIM: To study the differentiation characteristics and the optimal dosage and timing for bromodeoxyuridine (Brdu) labeling of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. METHODS: The rat marrow stem cells isolated by using Percoll (1.073 kg/L) were cultured and proliferated. The third passage cells were induced with dexamethasome, βglycerophosphate, ascorbic acid2phosphate, IGF1 and insulin. On day 21, the cells were analyzed by immunohistochemistry for type Ⅰ collagen and by histochemistry for alkaline phosphatase (AKP). The purified MSCs were incubated with Brdu at different concentrations (5, 10 and 15 μmol/L) for different time periods (12， 24， 48， 72 and 96 h), followed by immunohistochemistry for Brdu to identify the optimal Brdu concentration and incubation time period. RESULTS: After incubation for 21 d for induced differentiation into osteoblasts, type Ⅰ collagen and AKP were positively expressed. The incubation with 10 μmol/L Brdu for 72 h achieved over 98% of the labeling rate without producing obvious cell damages. CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into osteoblasts under certain conditions in vitro. The optimal Brdu labeling concentration and time period are 10 μmol/L and 72 h, respectively.
【Keywords】 MSCs; induced differentiation; osteoblast; Brdu
【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性. 方法： 利用密度为1.073 kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21 d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15 μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96 h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间. 结果： 诱导分化第21日, AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性. 10 μmol/L Brdu标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72 h后标记率在90%以上. 结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10 μmol/L，最佳时间是72 h.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷
0引言
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞. 因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注. 本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞. 并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70 g. 由西安大学医学院实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750 mL/L乙醇浸泡约5 min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨. 用PBS冲洗出骨髓细胞，经5 mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液. 在密度为1.073 kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500 r/min离心20 min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000 r/min离心5 min. 用加有100 mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6 cm的培养皿中培养，2 d后更换培养液，加入完全培养基. 并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2 d更换成完全培养基. 以后每3～4 d换液1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞. 待细胞生长融合到约80%，用0.2 g/L EDTA和2.5 g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，1∶2传代培养.
1.2.2传代后大鼠MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化生长良好的第3代（P3）细胞，以1×107个/L密度种于6 cm培养皿中，平皿中预先加入0.5 cm×1.0 cm无菌盖玻片. 待细胞长到约80%融合后，加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM诱导24 h，弃去. 加入诱导液，其中含0.1 μmol/L地塞米松、50 μmmol/L维生素C,10 μmmol/L β甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和100 mL/L胎牛血清. 同时，设立正常对照组，只加入含100 mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加. 分别诱导7，14和21 d. 取出盖玻片，PBS 冲洗，40 g/L多聚甲醛固定15 min. 然后应用抗Ⅰ型胶原mAb（Sigma）和ABC法（ABC试剂盒购于北京中杉公司）进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色. 加入诱导液组，以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP），以不加底物β甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.
1.2.3Brdu标记MSCs消化P3细胞，以0.5×108个/L将MSCs接种于12孔培养皿，在将要加入Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片. 当细胞铺满皿底40%时加入Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为5，10和15 μmol/L. 孵育12，24，48，72和96 h后取出盖玻片，用PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定15 min，应用抗Brdu mAb（Sigma）和ABC法进行免疫组织化学染色显示Brdu，除在正常血清封闭前以2 mol/L盐酸变性30 min外，其余均按试剂盒说明书进行操作. 以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照. 另外，将用10 μmol/L Brdu标记的MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.
1.2.4Brdu毒性观察以Brdu标记MSCs，同时以未经Brdu标记的MSCs作为正常对照. 在倒置相差显微镜（Olympus）下观察传代细胞的形态变化和生长状况，确定Brdu有无毒性.
统计学处理： Brdu免疫组织化学染色后，随机取10个非重叠视野（×100）计数Brdu阳性细胞数，Brdu标记率. 数据以x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行方差分析及LSDt两两比较，P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1原代培养的MSCs形态学变化原代培养中, 接种后数小时即可见部分细胞贴壁. 2～3 d时，贴壁细胞数量明显增多，逐渐伸展成为梭形. 贴壁细胞是以分散的克隆集落方式生长. 3～4 d时可见细胞集落增大. 7～10 d细胞迅速增生,呈辐射状排列. 高倍镜下可见细胞为长梭形，有2个或多个突起，细胞核椭圆形，有2～3个清晰的核仁（图1）. 培养至20 d时贴壁细胞接近80%～90%融合. 传代细胞在12 h内完全贴壁，重新变为梭形细胞. 细胞传代后以均匀分布的方式生长，生长迅速，大约7～10 d达到完全融合.
2.2MSCs向成骨细胞的分化在诱导分化的第7日，细胞由梭形开始变为多角形, 第14日，部分细胞变宽大，且伸出多个丝状突起；AKP染色呈黑褐色，Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性不明显. 第21日，AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性（图2）. 正常对照组和阴性对照实验均未见明显染色.
2.3Brdu标记率以不同浓度Brdu标记发现（表1，图3）：标记48～72 h，5 μmol/L的标记率约为70%，10 μmol/L的标记率约为90%，该标记率与15 μmol/L Brdu的标记率没有显著差别. 同时发现：以不同时间标记，随着标记时间延长阳性细胞数增多. 标记72 h细胞阳性率＞90%, 但标记时间继续延长（96 h）标记细胞数目无明显增多. 阴性对照未见染色. 为此，我们选用终浓度为10 μmol/L的Brdu标记72 h作为最佳标记浓度和时间进行后续试验. 连续传10代后仍可见Brdu免疫染色阳性细胞，但数量越来越少. 在相差显微镜下观察细胞的形态及生长增殖速度，与正常对照组细胞比较未见明显差异.表1不同浓度Brdu在不同时间标记MSCs的标记率（略）
3讨论
骨髓MSCs具有自我更新和多向分化的潜能［1］， 已经成为重要的组织工程种子细胞［2-3］. 由于MSCs具有多种标志，而目前尚未筛选到其独有的标志分图310 μmol/L Brdu标记MSCs 12(A, ×400), 48 (B, ×100)和72 h (C, ×100)
子，给MSCs的鉴定带来一定困难［4］. 目前MSCs的鉴定常采用两种方法：①排除法：骨髓中不表达内皮细胞、成纤维细胞、造血干/祖细胞、血细胞抗原的细胞，而上述细胞分别有CD34和/或CD45的表达：②逆推法：在培养过程中，给予适当刺激因子，细胞出现分化表型，如向成骨、成脂方向诱导分化等，从而逆推其为MSCs［5］. 我们采用后者，给细胞加入诱导液，诱导其向成骨细胞分化，诱导成功，从而证实得到的细胞即为MSCs.细胞移植首先遇到的问题是如何标记移植的细胞，进而跟踪其存活、生长、分化的过程. 细胞增殖周期包括G1，S，G2和M期4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制. Brdu是一种嘧啶类似物，其尿嘧啶的碱基嘧啶环中与5位C原子连接的甲基被溴代替. 当细胞处于DNA合成期而同时又有Brdu存在时，就会有Brdu掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种Brdu在胞核的DNA中长期存留. 本实验我们采用Brdu标记MSCs后，细胞的形态、增殖均不受影响，故用Brdu标记细胞较为安全可靠. 且传代细胞可连续被标记，提示移植细胞可在体内连续追踪观察，为进一步追踪活体内的移植细胞的动态变化提供了理论指导. 与同位素和荧光标记技术相比较，Brdu抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，没有放射性，化学染色可直接观察其在细胞内的掺入情况，检测的特异性高、标记率高，而且实验过程迅速、简便、安全，因此是反映细胞增殖及追踪移植细胞的理想标记方法［6］. 我们确定了Brdu标记骨髓MSCs的最佳浓度和时间是10 μmol/L，72 h.
【】
［1］ Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［J］. Science, 1999, 284(5411):143-147.
［2］ Hakuno D, Fukuda K, Makino S, et al. Bone marrowderived regenerated cadiomyocytes (CMG cells) express functional adrenergic and muscarinic receptors［J］. Circulation, 2002, 105(3):380-386.
［3］ 江逊, 崔鹏程, 陈文弦,等.人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察［J］.第四军医大学学报,2003，24(4):351-353.
［4］ Tocci A, Forte L. Mesenchymal stem cell: Use and perspectives ［J］. Hematol J, 2003, 4(2):92-96.
［5］ 苏立，陈运贞．骨髓间充质干细胞的生物学特性［J］．医学综述，2004，10（5）：306-310.
［6］ Gratzner HG. Monoclonal antibody to 5bromo and 5iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication ［J］. Science, 1982, 218(4571): 474-475.
