西安市麻疹野病毒核蛋白基因序列分析
【关键词】 麻疹
【Abstract】 AIM: To study the genotype and characteristics of measles virus found in Xian city. METHODS: Measles viruses were separated from the pharynx swabs of suspected measles patients within 3 d of rash emergence. The total RNA was isolated from the measles virus by the phenolchloroform extraction method. Then we amplified the 450 bp nucleotide segment of carboxylterminal region of nucleoprotein gene by RTPCR, determined the sequence of the amplified segments, analyzed and compared the sequence with those in Genbank. RESULTS: Eight strains of positive measles virus were isolated from 13 samples of pharynx swabs, the positive rate 62%. All of the isolated viruses were H1 genotype of measles virus. CONCLUSION: H1 genotype remains predominant strain of measles virus circulating in Xian city, which is consistent with the strain of measles virus circulating in China.
【Keywords】 measles virus; nucleoprotein gene; sequencing analysis; RTPCR
【摘要】 目的:研究西安市流行麻疹病毒的基因型别及特征. 方法:采集3 d内出疹麻疹患者咽拭子标本分离病毒，提取病毒RNA，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增病毒的核蛋白N基因碳末端的450 bp的核苷酸片段，对扩增产物进行序列测定和比较分析. 结果:采集咽拭子标本13份，分离出麻疹病毒8株，分离率62%；8株麻疹病毒均为H1基因型. 结论:H1基因型麻疹病毒是西安市麻疹病毒的优势流行株，与全国麻疹病毒流行株无明显差异.
【关键词】 麻疹病毒；核蛋白基因；序列分析；RTPCR
0引言
麻疹病毒只有一个血清型，但近年来国内外通过对麻疹病毒的基因分析，已发现有8个基因组（A～H），共20个基因型在人类中流行或曾经流行. 在麻疹病毒的结构基因中，核蛋白（N）基因和血凝素（H）基因是变异最大的基因，而N基因碳末端450个核苷酸为该基因最大变异区. 世界卫生组织（WHO）已规定可以通过麻疹N基因碳末端450个核苷酸的序列来划分该病毒的基因型别. 为掌握西安市麻疹病毒的基因型别及特征，我们对2005年分离的麻疹病毒核蛋白部分基因作序列测定和比较分析.
1材料和方法
1.1材料200503～04在西安市采集3 d内出疹麻疹患者咽拭子标本13份, 保存在含20 mL/L小牛血清、终浓度为1×106 kU/L的青霉素和链霉素的DMEM培养液中，-20℃冻存.
1.2方法
1.2.1病毒分离标本接种在EtsteinBarr（EB）病毒转化的狨猴淋巴母细胞（B95a）上，吸附1 h后弃上清，换含20 mL/L小牛血清RPMI1640培养液8 mL，培养14 d，每天观察细胞液pH值和细胞病变（CPE），必要时换液或盲传1代，当CPE≥75％时收冻. 用兔抗麻疹免疫血清对分离株作中和鉴定.
1.2.2RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）用酚氯仿抽提法提取病毒悬液中的RNA［1-3］. 参照H1基因型和Edmonston株的序列设计引物，上游引物为601（序列为5′GCATATTTTAGATTAGG3′）,下游引物为631（序列为5′GGCGGCCTTTTGCACCTAGT3′）. 601和631引物分别位于N基因起始编码1079～1096和1576～1595处. 用于扩增N基因碳末端的516个核苷酸（bp）片段. 在逆转录酶的作用下，用下游引物631于PCR仪上42℃ 45 min，95℃ 5 min，合成cDNA. 用601，631引物和PCR试剂盒进行PCR扩增，首先高温启动95℃ 1 min,然后进行30个循环的扩增：95℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min；最后72℃延伸10 min. 每次实验设去离子水为阴性对照，扩增后的产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，用QIA quick PCR purification kit试剂盒纯化扩增产物.
1.2.3序列测定使用601引物和Big DyeTM Terminator V 3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 试剂盒进行标记反应，标记反应如下：90℃ 10 s，50℃ 5 s，70℃ 4 min，共25个循环，最后70℃ 10 min延伸. 标记后的产物在CENTRISEPCOLUMNS试剂盒再一次纯化，去除多余非特异性荧光. 纯化后的产物在ABI377测序仪上，经50 g/L聚丙烯酰胺、8.3 mol/L尿素凝胶电泳，自动完成序列测定和校对分析［4-6］.
1.2.4序列分析调出GeneBank里的20个基因型代表株，用BioEdit软件对这些株和我们分离的8个毒株N基因的450 bp序列进行变异对比分析和基因亲缘性分析，做基因亲缘性关系树.
2结果
2.1麻疹病毒分离和鉴定13份标本中有8份标本在B95a细胞上出现细胞融合病变. 经中和试验鉴定，全部为麻疹病毒. 麻疹病毒分离率为62%. 野毒株标准命名见表1. 表18株麻疹病毒的命名
2.2RTPCR结果8株病毒PCR产物纯化后，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定在567 bp处有一明显阳性带(图1).
2.3麻疹病毒的基因序列和相关序列比较西安市8株麻疹病毒N基因C末端450个核苷酸序列分析表明，shannxi052，shannxi054，shannxi055，shannxi058 4株序列完全相同，因此在图2中仅列出shannxi051，shannxi052，shannxi053，shannxi056，shannxi057的序列. 与20个已知基因型参考株的对应序列做基因亲缘性分析，结果均为H1基因组. 而在西安市各毒株之间，shannxi053变异较大，和shannxi051有7个碱基不同. H1基因型是麻疹病毒型内变异最大的基因型，可进一步分为H1a和H1b两个亚组，H1a的450个核苷酸和H1b的差异在2.00%～4.00%. H1基因型的450个核苷酸和A基因型代表株Edmonston的基因差异在6.00%～7.33%；与H2基因型代表株China941的基因差异在5.11%～7.56%.
3讨论
2004年西安市麻疹报告发病率突然上升至10.61/10万,特别是200412/200502共报告麻疹病例843例，占全省麻疹报告数的68％. 导致西安市麻疹发病数剧增的原因，有专家提出怀疑可能与麻疹流行株发生较大变异有关. 为此，200503～04我们在西安市采集麻疹患者咽拭子标本并分离到8株麻疹病毒进行序列分析，结果全部属于H1基因型，与前些年在西安市及我省其他地市分离到的麻疹病毒型别一致，也与全国其它省份一致，说明麻疹病毒H1基因型仍是陕西省麻疹病毒的优势流行株，是引起本次西安市麻疹发病率大幅上升的病原病毒.
麻疹病毒的复制首先依赖于血凝素蛋白（HA）吸附到细胞膜上的麻疹病毒受体，HA与特异性受体结合后与F蛋白共同作用和细胞膜结合，将核壳体释放到细胞质中. CD46 （membrane cofactor protein,MCP）是麻疹疫苗株和麻疹病毒实验室株（A组麻疹病毒）的主要细胞受体，但近年分离的麻疹野病毒用不同于CD46的另外一个蛋白作为细胞受体, 因此，很难在Vero细胞上分离成功麻疹野病毒. 人类SLAM（Signalling lymphocyteactivation molecule;CDw150）在有活性的T和B细胞表面上表达，是新发现的麻疹病毒细胞受体，麻疹野病毒、实验室株和麻疹疫苗株都能在有CDw150表达的细胞上产生典型的病变［7］. 1999年我们从日本国立感染症研究所引进了B95a细胞，并于2000年春首次从麻疹患者中分离出了麻疹野病毒.
过去认为麻疹病毒相对稳定，但近年来一些国家分离的麻疹病毒的H和N基因已有较大的变异. 我国1960年在上海分离的麻疹病毒属A基因型，A型是以Ed株为代表. 目前国际上使用的疫苗株（包括的沪191）皆属此型. 1993年至今分离的麻疹病毒主要为H1基因型［3］，这个新基因组和其它已知的7个基因组之间有最大的基因变异，HA基因和N基因变异在核苷酸水平分别达6.9%和7.0%，所提示的HA和N蛋白氨基酸变异分别为5.0%和4.8%.
H1基因型是目前我国流行的优势病毒株. 陕西省2000～2003年共分离出麻疹病毒15株，进行核酸测序和基因分型的９株均为H1基因型，其中2000年的的流行株为H1b亚组，2001年的流行株为H1a亚组，西安市本次麻疹流行株仍为H1a亚组. 虽然现有的麻疹疫苗株仍然对所有已知的麻疹病毒基因型具有保护作用，但人类疫苗免疫血清中和H1基因型的滴度低于中和Edm和Chi株滴度的2～5倍，麻疹疫苗免疫后血清中特异性抗体中和麻疹野毒株的能力大大低于疫苗株［8］. 此次西安市麻疹流行不排除疫苗保护性下降的因素，其他因素诸如免疫空白、无效接种等有待血清学研究后进一步分析［9］. 为使麻疹减毒活疫苗更好的发挥作用，持续监测麻疹病毒变异趋势，防止病毒变异积累到一定程度可能导致的免疫逃逸将是一个重要的课题.
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