盐酸贝那普利对自发性高血压大鼠肾脏纤维化的影响

         作者： 王先梅，杨丽霞，宋武战，齐峰，郭传明，石燕昆，赵颖 魏玲，王燕

【关键词】  血管紧张素转换酶抑制药；肾素

    【Abstract】  AIM:  To observe the effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor (benazepril) on intrarenal reninangiotensin system (RAS)   in spontaneously hypertensive rats (SHR) and to explore the mechanism by which benazepril protects kidney from renal interstitial fibrosis. METHODS: The animals were randomly divided into 3 groups: spontaneously hypertensive rats treated with benazepril (SHRB) group and SHR group and WistarKyoto (WKY) group. Using the methods of pathological examination and computer processing, the renal collagen area in kidney was observed. The area of collagen was examined by the image analysis system. The renal local angiotensinconverting enzyme (ACE) activity was detected by ultraviolet spectrophotography. Renal angiotensin II (Ang II) concentration was measured by radioimmunoassay. The mRNA expressions of type I and type III collagens in renal tissue were analyzed using the reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR). RESULTS:  The area of collagen was significantly decreased in SHRB group compared to SHR group (P<0.01). The renal local ACE activities were (27.6±6.5) nmol/(min・mg) in SHRB group and (53.4±8.2) nmol/(min・mg)  in SHR group and (25.3±6.9) nmol/(min・mg)  in WKY group; there was a significant decrease  in SHRB group as compared with SHR group (P<0.01), and there was no significant difference between SHRB and WKY groups (P>0.05). The contents of Ang II in renal local tissue were also markedly lower in SHRB group than in SHR group［(49.3±16.1) ng/g  vs (83.4±8.2) ng/g, P<0.01)］. There was no significant difference between SHRB and WKY (P＞0.05). The relative  levels of mRNA expressions of type I and type III collagens in renal tissue were markedly lower in SHRB group than in SHR group (P<0.01, respectively). CONCLUSION: Benazepril could attenuate rat renal fibrogenesis by inhibiting the activity of the renal RAS and decreasing collagen synthesis in renal tissue.

    【Keywords】  angiotensinconverting enzyme inhibitors; reninangiotensin system; renal fibrosis;  collagen

    【摘要】 目的： 观察血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）肾内肾素―血管紧张素系统（RAS）的影响，探讨盐酸贝那普利抗肾脏纤维化的机制. 方法： 应用病理检查、机分析、放射免疫、分光光度法和逆转录―聚合酶链式反应等方法，检测贝那普利组（SHRB）、SHR组（SHR）及对照WistarKyoto组（WKY）大鼠肾脏间质胶原面积、肾脏血管紧张素转换酶（ACE）活性、肾脏局部血管紧张素II（Ang II）水平及肾脏组织I，III型胶原mRNA表达. 结果： SHRB组肾脏胶原面积比SHR组明显减少（P<0.01）. SHRB组肾皮质提取液ACE活性为（28±6）nmol/（min・g），SHR组为（53±8）nmol/(min・g)，WKY组为（25±7） nmol/(min・g). SHRB组肾皮质提取液ACE活性比SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY组相比，无显著差异. SHRB组肾皮质组织匀浆液Ang II水平为（49±16）ng/g ，SHR组为（83±8） ng/g ，WKY组为（43±14）ng/g. SHRB组肾皮质组织匀浆液Ang II水平比SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无显著差异（P＞0.05）. SHRB组肾脏组织I型胶原及III型胶原mRNA表达相对含量也均明显低于SHR组（P均<0.01）. 结论： 贝那普利可通过减少肾脏胶原的合成和抑制肾内的RAS而减轻肾脏的纤维化.

    【关键词】 血管紧张素转换酶抑制药；肾素血管紧张素系统；肾脏纤维化；胶原

     肾素-血管紧张素系统（RAS）除了作为一种循环内分泌系统外，亦作为一种肾脏局部内分泌、旁分泌和细胞内分泌系统，在肾脏疾病的发生中发挥重要作用，与肾脏纤维化关系密切. 血管紧张素Ⅱ (Ang II)是RAS中最主要的生物活性物质之一，参与肾脏损害的发生发展［1］. 研究证实，Ang II可引起血流动力学紊乱、水盐代谢失调以及促进肾脏疾病进展. 高血压终末期常常伴有肾脏损害. 因此，我们选择自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）为实验模型，探讨血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）盐酸贝那普利对高血压肾脏纤维化的影响及其作用机制，为ACEI在减轻肾脏纤维化中的应用提供新的理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料13 wk龄雄性SHR 12只以及年龄、性别匹配的WistarKyoto正常血压大鼠（WKY）6只，均由第四军医大学实验动物中心提供. 盐酸贝那普利 (诺华制药有限公司，商品名为洛汀新)；PCR引物由上海博雅生物技术有限公司合成；RTPCR试剂盒 (TaKaRa公司). 大鼠尾动脉血压测量仪(中日友好制造). 血管紧张素转换酶（ACE）测定试剂盒购自海军总医院. Ang II浓度的测定按原子能研究院提供的试剂盒的测定方法检测.

    1.2方法

    1.2.1动物分组及测压将动物共分为3组： ① WKY组（n=6）；SHR随机分为： ② SHR组（n=6）. ③ SHR+盐酸贝那普利组（SHRB组，n=6）. SHRB组每日经胃管给予盐酸贝那普利 10 mg/(kg・d)，WKY和SHR组每日经胃管给予等量的生理盐水. 共给药8 wk. 戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，于冰上分离肾脏. 将部分肾组织中性甲醛固定后作石蜡包埋切片，其余组织液氮速冻，-80℃冰箱保存待用.  尾压法测定血压，1次/wk.

    1.2.2肾组织病理检查将切片行HE染色及Masson染色，光镜下观察. Masson染色计算机图像半定量分析间质纤维化程度，胶原面积比(%)=（胶原面积/总面积）×100%.

    1.2.3肾组织ACE活性测定取肾皮质组织100 mg，加入0.02 mol/L磷酸钾缓冲液2 mL匀浆，4℃, 13 000 g/min离心30 min，上述缓冲液洗涤3次. 沉淀以5 mmol/L CHAPS重新混匀，4℃过夜，4℃, 15 000 g/min离心30 min，取上清液，-20℃保存待测. 采用分光光度法测A228 nm值.

    1.2.4肾脏皮质局部Ang II含量测定肾皮质称质量后，在含0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L NaH2PO4, 0.05 mol/L Na2HPO4, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 8羟基喹啉的缓冲液（pH 7.4）中进行匀浆.

    1.2.5肾皮质I型和III型胶原表达采用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）. I型胶原引物： 上游5′  TGC CGT GAC CTC AAG ATG TG  3′，下游5′  CAC AAG CGT GCT GTA GGT GA  3′, PCR产物长度为462 bp；扩增条件： 94℃，变性5 min，然后再94℃变性1 min, 60℃退火30 s, 72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10 min. III型胶原引物： 上游5′  AGA TCA TGT CTT CAC TCA AGTC  3′, 下游5′  TTT ACA TTG CCA TTG GCC TAG  3′，PCR产物长度为480 bp；扩增条件除退火温度为64℃以外其余与I型胶原一样. 内对照GAPDH长度为231 bp，引物： 上游5′ ACG GCA AAT TCA ACG GCA CAG TCA 3′ ，下游5′ TGG GGG CAT CGG CAG AAG G 3′. 退火温度为61℃. 所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统（UV Transilluminator）进行图像分析测得其密度比值.

    统计及处理： 实验数据均以x±s表示，各组间比较采用方差分析及LSDt检验，组间方差不齐时，采用秩和检验. P＜0.05表示有统计学意义.

    2结果

    2.1大鼠收缩压的变化用药后第1, 2, 4, 6, 8周，SHRB组尾动脉血压比用药前及SHR组明显降低（均P<0.01），SHRB组血压用药后第1周即开始较用药前下降（P<0.01），但与WKY相比仍较高（P<0.01）. 用药2 wk后，SHRB组血压即与WKY组无明显差别（P＞0.05, 表1）. 表1各组大鼠尾动脉血压变化

    2.2肾组织的病改变HE及Masson染色均显示SHR组肾脏组织间质增宽，肾小管上皮细胞萎缩，成纤维细胞增生，间质和小血管周围胶原纤维环绕成网格状. SHRB组肾脏纤维化程度与SHR组相比明显减轻，胶原面积比较SHR组明显减少（P<0.01）. WKY组大鼠未见肾脏间质纤维化. WKY, SHR和SHRB3组的大鼠肾脏间质胶原面积比分别为（3.5±2.3）%, （27.3±4.2）%和（10.4±4.8）%.

    2.3肾组织ACE活性的改变WKY, SHR和SHRB3组的肾皮质提取液ACE活性分别为（25±7），（53±8），（28±6）nmol/（min・g），SHRB组较SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无统计学意义.

    2.4肾皮质Ang II含量的变化 WKY, SHR和SHRB组的肾皮质组织匀浆液Ang II水平分别为（43±14），（83±8），（49±16） ng/g， SHRB组较SHR组明显降低（P<0.01），但与WKY相比无统计学意义.

    2.5肾皮质I型和III型胶原mRNA表达相对含量的变化WKY, SHR和SHRB3组的肾脏I型胶原mRNA/GAPDH mRNA比值分别为0.28±0.04, 1.39±0.10和0.33±0.06. 肾脏III型胶原mRNA/GAPDH mRNA比值分别为0.38±0.04, 0.85±0.09和0.39±0.11. SHRB组肾脏I，III型胶原mRNA表达相对含量均比SHR组明显下降（P<0.01），但与WKY相比无显著差异（图1）.

    A： I型胶原；B： III型胶原；C： 内对照GAPDH. M:  marker；WKY:  WistarKyoto正常血压大鼠；SHR： 自发性高血压大鼠；SHRB： SHR+盐酸贝那普利.

    3讨论

    我们的研究结果显示，SHR应用ACEI后，第1周尾动脉血压即明显下降，第2周血压已降至正常水平，与WKY无明显差别，此后8wk内血压均维持在正常水平. SHRB组大鼠肾间质胶原面积比明显比SHR组减少，肾脏皮质ACE活性明显降低，肾脏局部Ang II水平也明显下降. 同时，肾脏组织I，III胶原mRNA表达含量也比未治疗的SHR减少. 有研究表明肾脏局部的RAS活化可引起肾脏纤维化，此作用是通过血管紧张素1型受体（AT1）活化实现的. AT1受体与肾小管间质病变有关，肾间质成纤维细胞上也有丰富的AT1受体的表达. AT1受体与Ang II结合后，可刺激肾间质细胞产生胶原III［2］. I, III型胶原是间质型胶原的主要成分，正常肾内含有少量的I型胶原. 体外培养的大鼠系膜细胞能合成I, III型胶原. 某些细胞因子如转化生长因子β能促进体外培养的多种细胞合成胶原. 研究［3］表明，Ang II能促进肾脏表达转化生长因子β，从而使胶原合成增加. ACEI通过抑制Ang II的生成，同时也抑制了转化生长因子β的表达，使胶原合成减少. 还有研究证实，连接组织生长因子在肾脏的纤维化进程中发挥重要作用，ACEI还可使连接组织生长因子表达下调，从而抑制肾脏纤维化［4-5］.

    RAS在高血压慢性肾脏损伤的发病机制中具有重要意义. RAS系统中的Ang II作为其中的重要血管活性肽不仅产生血液动力学效应，尚存在不依赖于血液动力学的多种效应，在肾脏损害方面主要表现为通过转化生长因子β促进各种肾脏固有细胞增殖，促进炎症细胞浸润与吞噬、黏附，促进肾小球细胞外基质成分增多［6］等. ACEI用于治疗高血压肾脏纤维化的机制可能有： ① 血流动力学作用： 有效降低系统高血压，同时扩张出球小动脉大于扩张入球小动脉，降低球内高压. ② Ang II能改变肾小球滤过膜孔径屏障，增加大孔物质通透性. ACEI阻断了Ang II的效应，故能减少尿蛋白的滤过. ③ ACEI可抑制细胞增殖，减少肾小球细胞外基质成分沉积，延缓肾纤维化进展. 此外ACEI尚可使血管紧张素的另一条代谢途径中具有利尿扩血管作用的Ang (1～7)水平增加，Ang (1～7)产生与Ang II相反的生理作用［7-8］.

    在我们的研究中，发现SHR应用贝那普利后肾脏的胶原面积比并未完全降到正常，仍然比WKY明显增加，说明ACEI并不能完全逆转肾脏的纤维化. 可能与ACEI不能阻止RAS非经典途径产生的Ang II有关. 另外，一些细胞因子如IL1、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子α、血小板衍生的生长因子和表皮生长因子可促进肾间质成纤维细胞I, III型胶原mRNA的表达，具有致纤维化作用，而ACEI并不能完全阻断这些细胞因子的表达.

　　【】

    ［1］   RuizOrtega M, Ruperez M, Esteban V, et al. Molecular mechanisms of angiotensin IIinduced vascular injury［J］. Curr Hypertens Rep, 2003,5（1）:73-79.

    ［2］    RuizOrtega M, Ruperez M, Esteban V, et al. Angiotensin II: a key factor in the inflammatory and fibrotic response in kidney diseases［J］. Nephrol Dial Transplant, 2006,21(1):16-20.

    ［3］    Wolf G, Ziyadeh FN, Thaiss F, et al. Angiontensin II stimulates expression of the chemokine RANTES in rat glomerular endothelial cells. Role of the angiotensin type 2 receptor［J］. J Clin Invest, 1997,100(5):1047-1058.

    ［4］    Ruperez M, Lorenzo O, BlancoColio LM, et al. The connective tissue growth factor is a mediator of angiotensin IIinduced fibrosis［J］. Circulation, 2003,108(12):1499-1509.

    ［5］    Esteban V, Lorenzo O, Ruperez M, et al. Angiotensin II, via AT1 and AT2 receptors and NFkappaB pathway, regulates the inflammatory response in unilateral ureteral obstruction［J］. J Am Soc Nephrol, 2004,15(6):1514-1529.

    ［6］    Grainger DJ. Transforming growth factor beta and atherosclerosis: so far, so good for the protective cytokine hypothesis［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(3):399-404.

    ［7］    Ferreira AJ, Santos RA. Cardiovascular actions of angiotensin(17) ［J］. Braz J Med Biol Res, 2005,38(4):499-507.

    ［8］    Maia LG, Ramos MC, Famandes L, et al. Angiotensin(17) antagonist A779 attenuates the potentiation of bradykinin by captopril in rats［J］. J Cardiovasc Pharmacol, 2004,43(5):685-691.