依达拉奉对脓毒性休克大鼠心肌细胞损伤的作用

          作者：霍小萍，顾学兰，刘良明，刁有芳，马春艳，陈家慧，李萍，卢是

【关键词】  依达拉奉；氧自由基；休克,脓毒性；心肌损伤

    【Abstract】  AIM: To investigate the effect of edaravone(ED), a novel free radical scavenger, on cardiac function and myocardial cell injury in rats with septic shock. METHODS: After treatment with three different doses (6.0, 3.0 and 1.5 mg/kg) of ED to rats 1 h after septic shock, changes of MAP, LVESP, LVEDP,±dp/dtmax were determined in 4 different time phases. The activities of SOD, CAT, LDH and the concentrations of MDA, LD in myocardial tissue were measured. The pathologic change of myocardial tissue was observed by HE staining. RESULTS: Compared with septic shock group, MAP,LVESP and +dp/dtmax were increased remarkably in ED treatment groups. The activities of SOD and CAT and the concentration of MDA in ED groups were close to those in normal control group. Histological examination showed congestion, edema and inflammatory cell infiltration in myocardial tissue, while ED treatment attenuated the above pathological changes of myocardium. CONCLUSION: ED has a satisfying therapeutic effect on cardiac dysfunction in rats with septic shock, which may be related to attenuating myocardial injury.

    【Keywords】  edaravone; Oxygen free radicals; shock, septic; Myocardial injury

    【摘要】 目的： 观察氧自由基清除剂依达拉奉（edaravone, ED）对脓毒性休克大鼠心脏功能和心肌损伤的作用. 方法： 在大鼠脓毒性休克后1 h用3个剂量ED (6.0, 3.0和1.5 mg/kg)，测定休克后4个时相点平均血压（MAP）、左室收缩末期压力（LVESP）、左室舒张末期压力（LVEDP）、左室压力上升及下降最大变化速率（±dp/dtmax）等心功能指标；取心肌组织测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、乳酸脱氢酶（LDH）活性和乳酸（LD）、丙二醛（MDA）含量，并观察形态学改变. 结果： 与脓毒性休克组比较，ED可显著升高MAP，LVESP和±dp/dtmax，并使SOD，CAT活性增强以及MDA浓度降低接近对照组；组织学观察可见模型组心肌充血、水肿及炎性细胞浸润等，ED可明显改善以上形态学变化. 结论： ED具有抗脓毒性休克心功能不全的作用，其机制与减轻心肌损伤有关.

    【关键词】 依达拉奉；氧自由基；休克，脓毒性；心肌损伤

     心功能不全和心肌细胞损伤是脓毒性休克的主要致命性并发症，有40%的脓毒症患者出现左、右心功能不全［1-2］. 脓毒症时菌体膜产生的内毒素（lipopolysaccharide, LPS）入血可直接或间接通过细胞因子和自由基的作用引起心肌损伤和心功能不全［3］,实验证实抗氧化剂谷胱甘肽加N乙酰半胱氨酸可明显减少脓毒症休克患者血液中活性氧浓度，改善心功能指数［4］. 依达拉奉［edaravone, ED, 3甲基1苯基2吡唑啉5酮（MCI186）］是新型强效的自由基清除剂，是临床治疗缺血性脑卒中的有效药物［5］. 我们通过观察ED对脓毒性休克大鼠心功能、心肌氧自由基和心肌病变化的影响，旨在为该药治疗脓毒性休克提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(200±20) g（第三军医大学野战外科研究所实验动物中心）；LPS（Sigma公司，来源： Escherichia.coli O111:B4，规格： 500 mg,批号： 024K4077）；ED注射液（商品名： 必存，南京先声东元制药有限公司，规格： 5 mL,10 mg，批号： 040283）；2002年美国FDA批准的抗重症感染药XigrisTM(又名Drotrecogin alfa)（美国Eli Lilly公司，规格： 20 mg/安瓿，批号: 2H1552）；乳酸（LD）、乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物技术工程研究所）；DU7500分光光度仪（美国Beckmen公司）；Powerlab/8 SP多功能生理记录仪（澳大利亚AD公司）；BX50显微镜(日本Olympus公司)；江苏捷达801病理医学影像系统.

    1.2方法

    1.2.1动物分组及病理模型复制将大鼠分为6组，每组10只. 对照组： 仅作手术对照并给予生理盐水；模型组： 尾静脉注射LPS,  8 mg/kg致内毒素休克后单纯给予等体积生理盐水；阳性药对照组： 以XigrisTM为阳性药对照，根据临床剂量换算剂量为19.34 mg/kg；ED高、中、低剂量组： 给予ED的剂量分别为1.6, 0.8,  0.4 mg/kg. 在LPS复制脓毒性休克模型后1 h行药物治疗. 戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，右颈总动脉插管至左心室，左股动脉导管接血压计检测平均动脉压（MAP），左股静脉导管用于给药和输液.

    1.2.2心功能检测指标将左心室导管连接8道生理记录仪,应用Chart V4.1.2信号处理软件记录左室收缩末期压力（LVESP）,左室舒张末期压力（LVEDP）和左室压力上升及下降最大变化速率（±dp/dtmax）. 记录LPS注射后0, 2, 4, 6 h心功能指标.

    1.2.3心肌氧自由基测定在LPS后6 h心功能指标测完后，开胸取左心室两块0.5g组织，取其一用冰PBS冲洗干净，在PBS烧杯中剪碎及冰浴下匀浆，匀浆液在4℃下4000 r/min离心15 min，上清按试剂盒说明书应用分光光度仪检验LD, LDH, CAT, MDA及SOD含量.

    1.2.4心肌病理学观察取上步骤中另一块心肌经100 mL/L多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续冠状切片，切片厚度4 μm，HE染色，显微镜下观察并留存图像.

    统计学处理：  计量资料表示为x±s,用统计学软件SPSS 11.0的ANOVA法比较组间差异的统计学意义.

    2结果

    2.1ED对脓毒性休克大鼠心功能的作用模型组动物在休克4 h时平均动脉压（MAP）明显降低（图1A, P<0.05）,并呈继续下降趋势，ED高、中、低剂量均可显著升高MAP（P<0.01），休克6 h后ED升高MAP的效应随剂量增大而增强. 脓毒性休克后大鼠心脏LVESP显著下降（图1B），4 h后下降非常明显（P<0.01）,且呈进行性下降趋势，ED高、中、低剂量使LVESP升高并接近对照组水平，与脓毒性休克组比较升高非常显著（P<0.01）. 脓毒性休克大鼠+dp/dtmax也呈进行性下降（图1C），在4 h后下降非常显著（P<0.01），休克后2 h，ED中、低剂量组+dp/dtmax即可明显增强（P<0.05），休克4 h时ED各剂量组均使+dp/dtmax显著升高（P<0.01）并接近相同时相点正常水平. 脓毒性休克时大鼠LVEDP和-dp/dtmax无明显改变，除ED低剂量组在4h明显增强-dp/dtmax外（P<0.05），未见其他各剂量组对-dp/dtmax有影响作用（图1D, E）.aP<0.05, bP<0.01 vs对照组； cP<0.05, dP<0.01 vs模型组. A： 平均血压（MAP）；B： 左室收缩末期压力（LVESP）；C： 左室压力上升最大变化速率（+dp/dtmax ）；D： 左室舒张末期压力（LVEDP）；E： 左室压力下降最大变化速率（-dp/dtmax）.

    图1依达拉奉（ED）对脓毒症休克大鼠心功能各项指标的影响

    2.2ED对脓毒症休克大鼠心肌生化指标的影响模型组大鼠心脏组织中SOD, CAT活性呈不同程度降低(表1)，SOD活性明显低于对照组（P<0.05）；ED中、高剂量组SOD活性升高非常明显（P<0.05,  P<0.01）；ED各剂量组的CAT活性均明显高于模型组（P<0.01）；LDH在脓毒症休克时升高，ED各剂量组对LDH活性有降低作用，但差异不明显. 模型组MDA, LD升高，ED高剂量组能显著降低MDA（P<0.01），其他各组也不同程度地降低MDA，LD水平，但无统计学差异.表1依达拉奉（ED）对脓毒症休克大鼠心肌SOD, MDA, CAT, LD, LDH的影响

    2.3ED对脓毒症休克大鼠心肌形态学的影响光镜下观察到对照组大鼠心肌着色均匀完整，可见横纹和润盘，未见炎性细胞浸润. 模型组间质充血、水肿，血管扩张，炎性细胞浸润. 经ED治疗后心肌细胞结构完整，可见横纹和润盘，有少量炎性细胞浸润，未见明显细胞变性及坏死病灶. XigrisTM治疗后心肌细胞着色不均，有部分变性坏死，血管扩张，有灶性出血，炎症细胞浸润（图2）.

    3讨论

    ED是一种有效的羟自由基清除剂，通过清除氧自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制细胞损伤，临床已作为脑保护剂广泛用于急性脑梗死治疗［6］. 研究发现ED可明显降低糖尿病大鼠心肌硫代巴比士酸物质、增加SOD活性并有效维持心肌细胞直径和线粒体结构［7］,也有资料表明ED能明显降低局部缺血再灌注心肌家兔血液中MDA浓度，有效抑制局灶性缺血再灌注损伤［8］. 脓毒性休克时心肌损伤和心功能不全是多种炎症介质共同参与的结果，其中氧自由基被认为是致病的重要原因. 在脓毒症早期，自由基通过激活细胞核转录因子（NFκB或AP1），诱导细胞因子合成而起促炎症作用，继而在自由基和细胞因子的协同作用下激活内皮细胞，促进炎症介质和黏附分子合成，中性粒细胞呼吸爆发(respiratory burst)产生活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）并释放溶酶体酶而发挥毒性作用，导致细胞功能丧失和坏死，最终使器官、系统功能失调［9］. 因此脓毒症休克时防治ROS对心功能损伤具有重要意义.

    LVESP和+dp/dtmax为检测左心功能的指标，我们是国内外首次将ED用于治疗脓毒性休克大鼠的研究单位，发现模型组动物MAP明显降低， LVESP和+dp/dtmax降低非常显著，说明模型组出现明显心功能不全的病理变化，ED治疗后各剂量可显著升高MAP, LVESP和+dp/dtmax，并随剂量增大而增强，表明ED有改善左心功能不全的作用. 模型组的心脏组织中SOD, CAT活性明显降低，氧自由基代谢产物MDA升高，ED可使SOD, CAT活性增强，强度与剂量成正比，并显著降低MDA，表明该药可以增强心肌组织的抗氧化能力,清除氧自由基. 模型组心肌组织水肿、出血及炎性细胞浸润，ED能明显减轻上述病理变化，证明该药通过ROS减少防治了LPS造成的心肌损伤.

    XigrisTM的有效成分为重组活化蛋白C，是人体内的蛋白，其作用可以平衡脓毒血症的凝结（血液凝结）和促进纤维蛋白溶解，该药降低了重度脓毒症患者近20%的死亡风险,但能引起出血等不良反应［10］. 本资料提示该药可以部分改善心功能不全，其机制可能与心肌细胞氧自由基代谢无关，但心肌有较重的出血变化.

    由于脓毒症休克是临床危重患者的重要死亡原因之一，尚无有效的治疗药物，基于以上试验结果，我们认为ED具有明确的作用机制，对于脓毒症休克的治疗具有进一步研究的价值和一定的开发潜力.

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