金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响
【关键词】 金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪
【Abstract】 AIM: To inverstigate the effects of exogenous Znmetallothionein (ZnMT) on antioxidative function and gene expression of SOD in weaning piglets. METHODS: Eighteen piglets (Duroc×Landrace×Yorkshire) were selected and divided into 3 groups (1, 2 and 3) randomly. The piglets were sport to produce stress. ZnMT of piglet liver dissolved in physiological saline were then injected into the piglets of group 1, 2 and 3 with the concentrations of 0, 0.8, 1.6 mg/kg, respectively. Three and 6 h later, 3 piglets were selected from each group randomly and slaughtered to get liver samples. The biochemical indexes related to antioxidation and the level of SOD gene expression in liver were determined. RESULTS: After ZnMT injection, the activities of SOD and GSHPX increased significantly (P<0.05)， the content of MDA decreased significantly (P<0.05), and the level of antireactive oxygen species and antisuperoxide anion had the trend of improvement. Six hours after ZnMT injection, the level of SOD gene expression in group 2 and 3 increased significantly as compared with that in group 1 (P<0.05). The level of SOD gene expression in group 2 and 3 at 6 h enhanced significantly as compared with that at 3 h. Thus, our data indicated that ZnMT treatment stimulated SOD mRNA expression in a time and dosedependent manner. CONCLUSION: Activity of antioxidase can be increased by supplement of ZnMT, thereby improving the power of antistress.
【Keywords】 metallothionein; antioxidative enzyme; gene expression; piglet
【摘要】 目的：用仔猪作模型，研究经锌元素诱导的外源性金属硫蛋白（ZnMT）对机体抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达的影响. 方法：选用杜长大杂交仔猪18头，随机分为3组(1,2和3）. 分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT 0 mg/kg (1组），0.8 mg/kg （2组）, 1.6 mg/kg （3组），让仔猪运动产生应激. 注射MT后3 h和6 h，分别从每组取3头仔猪屠宰取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平. 结果：在应激条件下，补充外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势. 在注射ZnMT后6 h，0.8 mg/kg，1.6 mg/kg组仔猪肝脏SOD基因表达水平比对照组显著提高(P<0.05). 0.8 mg/kg组和1.6 mg/kg组6 h SOD基因表达水平比3 h显著增加，表明MT对SOD基因表达的诱导与时间和剂量关系密切. 结论：补充外源性ZnMT可提高应激机体的抗氧化物酶活性，从而提高机体的抗应激能力.
【关键词】 金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪
0引言
应激可使机体脂质过氧化反应增强，继而通过产生自由基造成组织损伤, 致生物体病变，生产力下降，甚至死亡［1］. 金属硫蛋白（metallothionein, MT）是分子量低、富含半胱氨酸的金属结合蛋白. 研究表明，MT具有显著的清除自由基、抗脂质过氧化和增强机体免疫力的作用［2-3］. 因此，MT通过清除自由基，可增强抗氧化酶的活性，阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤，减少DNA损伤. 因而将MT应用于动物，完全有可能达到缓解氧化应激，提高生长速度，减少疾病的发生，减缓鲜肉氧化速度，延长动物利用年限，提高效益的目的. 但以往有关金属硫蛋白的抗氧化、抗应激研究以内源性为主，而且大都仅从抗氧化酶的活性变化来探讨金属硫蛋白清除自由基、抗氧化的作用. 有关MT在猪体内的研究鲜见报道. 基于此，我们以杜长大杂交仔猪为对象，通过注射外源性ZnMT，测定肝脏与自由基有关的生化指标以及肝脏中SOD基因表达水平，从蛋白和基因水平探讨外源性ZnMT在应激状态下对抗氧化酶的影响.
1材料和方法
1.1材料选用胎次、日龄相同并且体质量相近的杜长大三元杂交雄性仔猪18头，14 d一次性断奶， 单栏饲养，自由采食和饮水. 试验前体质量（4.42±0.24）kg. 屠宰前1 d停食，不断水. 梯度PCR仪：德国Eppendorf生产，型号为5331055888；稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂生产，型号为DYY6B；凝胶成像系统：美国UVP Biolmaging System生产，型号为GDS8000；紫外分析仪：北京六一仪器厂生产，型号为WD9403B；紫外分光光度计：德国Eppendorf生产，型号为603105430；超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司生产，型号为BD396LT65W；台式离心机： 德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5415D；低温离心机：德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5810R；微波炉：青岛海尔股份有限公司生产，型号为HR6702DW. 猪肝ZnMT：本课题组提取的产品；BIOXYTECH SOD525TM试剂盒：购自OXIS公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒、超氧阴离子(SOA)自由基测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；ISOGEN总RNA抽提试剂盒：购自日本基因株式会社；RTPCR试剂： 购自Amersham Pharmacia Biotech公司；琼脂糖及Tris： 购自Roche公司；Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder：购自MBI Fermntas公司.
1.2方法
1.2.1试验设计将18头供试仔猪，随机分为3组，每组6头. 驱赶仔猪使其产生应激，然后3组分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT 0 mg/kg（1组），0.8 mg/kg（2组）,1.6 mg/kg（3组）. 在注射MT后3 h和6 h，分别从每组随机抽取3头仔猪，从前腔静脉放血屠宰，取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平.
1.2.2样品采集解剖时取两份1 g左右的肝脏迅速用无菌锡铂纸包好并编号于液氮中速冻，再转移至-70℃冰箱中以备总RNA的抽提和肝脏上清液的制备.
1.2.3肝脏上清液的制备取0.2 g左右经低温保存的肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称质量，放入玻璃匀浆管中，然后用移液管量取预冷的生理盐水(8.6 g/L)，生理盐水的体积是组织块质量的9倍. 将匀浆管下端插入盛有冰水混合物的器皿中，上下转动捣杆数10次，充分研碎，使组织匀浆化. 将制备好的100 mL/L的匀浆在4℃，3000 r/min离心15 min，取上清液.
1.2.4肝脏中与抗氧化有关的生化指标的测定肝脏上清液中SOD活性, GSHPX, MDA, ROS和SOA自由基水平的测定按各试剂盒说明书操作.
1.2.5基因表达分析采用半定量RTPCR方法，以3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内标［4］.
1.2.5.1总RNA的提取采用ISOGENLS总RNA抽提试剂盒，按说明书操作，提取的总RNA经紫外分光光度计测得A260/A280在1.8~2.0之间，可作为逆转录反应的模板.
1.2.5.2引物设计根据网上()发表的基因序列（SOD：E06791， GAPDH：AF017079 ）采用引物设计软件进行设计，SOD上游引物：5′ ATTCATGGCGACGAAGGC 3′, 下游引物：5′ TCAATTACACCACAGGCCA3′, 扩增长度453 bp；内标GAPDH上游引物 5′ TGAACGGATTTGGCCGCAT3′, 下游引物5′ TTCTCCATGGTCGTGAAGA3′,扩增长度297 bp；引物均由日本株式会社DNA合成事业部合成.
1.2.5.3RTPCR反转录聚合酶链式反应(RTPCR)用ReadtoGo RTPCR beads试剂采用一步法进行.
1.2.5.4RTPCR产物定量取15 μL PCR扩增产物于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳（含溴化乙锭），在凝胶成像系统下观察结果并拍照. 采用图像处理系统对PCR产物条带进行密度扫描，以3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为RTPCR的质控，将待测SOD基因表达与其对应GAPDH表达的比值进行比较后得出一相对量，从而出各组的基因表达量的相对变化量.
统计学处理：计量数据以x±s表示. 采用SAS6.12统计软件进行方差分析(GLM过程)，并用Duncan法进行多重比较.
2结果
2.1MT对仔猪肝脏抗氧化能力的影响仔猪应激时注射外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性升高，MDA含量降低，抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势. 尤其在注射ZnMT后6 h，肝脏SOD，GSHPX活性，MDA含量各组比较差异具有统计学意义(P<0.05，表1).
同时由表1知，注射相同剂量ZnMT，6 h SOD，GSHPX活性比3 h提高，且Ⅲ组6 h SOD，GSHPX活性比3 h提高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.01). 各组肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平6 h与3 h相比也有提高的趋势.表1不同剂量的MT对仔猪肝脏中与抗氧化有关的指标的影响
2.2MT对仔猪肝脏SOD基因表达水平的影响由表2和图1,2可知，注射MT后3 h各组相比，肝脏SOD基因表达水平差异不显著(P>0.05). 注射MT后6 h各组相比，Ⅲ组肝脏SOD基因表达水平比Ⅰ组显著提高(P<0.05). 注射相同剂量ZnMT在不同的时间，第1组3 h与6 h肝脏中SOD基因表达水平相比差异不显著(P>0.05). 第2组和第3组6 h肝脏中SOD基因表达水平比其3 h的显著提高(P<0.05).表2不同剂量的MT对仔猪肝脏中SOD基因表达水平的影响
3讨论
正常情况下，机体存在一个完整的包含酶系和非酶系的抗氧化系统，抗氧化酶有SOD，GSHPX等，非酶系有VE、还原性谷胱甘肽等，均有清除自由基的作用. 在他们的协同作用下，使体内过多的自由基转变为无害的水，起到抗氧化的作用. 羟自由基是最活跃，也是毒性较大的含氧自由基. 由于至今体内尚未发现羟自由基的清除酶系，MT有效地抗羟自由基作用显得重要. Adel等［5］比较了MT与谷胱甘肽抗羟自由基保护DNA的作用，发现当MT浓度为13 μmol/L时，DNA的降解几乎完全被抑制，而10 mmol/L的GSH才能达到此作用. 而且在某些应激情况下，GSH水平下降，而MT合成增加. 本试验结果表明，注射外源ZnMT后，在一定的时间和浓度下，可显著提高仔猪肝脏SOD，GSHPX的活性，降低肝中MDA的含量. 肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子的水平也有提高的趋势, 从而提高机体的抗应激能力.
本结果同时表明，仔猪应激时，外源性补充ZnMT一段时间后，SOD mRNA表达水平提高，SOD的活性增加. Sugino等［6］研究小鼠的黄酮细胞发现SOD活性还受精胺的调控，这种调控是发生在转录水平. ZnMT中半胱氨酸含量丰富，在巯基化合物生成的同时，并有精氨酸残基，这样提供了SOD活性增强的物质基础.
【】
［1］ 祁克宗.内毒素性微循环山羊氧自由基代谢的研究［J］.农业，1999,32(3): 90-95.
［2］ Zhou ZB. Effect of Zn7metallothionein on oxidative stress in liver of rats with severe thermal injury［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003,24(8): 764-760.
［3］ 郑军恒，李海洋，茹刚，等.金属硫蛋白清除羟自由基的研究［J］.北京大学学报:科学版，1999,35(2):573-576.
［4］ Hou DX, Fukuda M, Fujii M, et al. Transcriptional regulation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: quinone oxidoreductase in murine hepatoma cells by 6(methylsufinyl)hexyl isothiocyanate, an active principle of wasabi (Eutrema Wasabi Maxim.)［J］. Cancer Lett, 2000, 161: 195-200.
［5］ Adel J, de Ruiter N. Inhibition of hydroxyl radicalgenerated DNA degradation by metallothionein［J］. Toxicol Lett, 1989,47: 191-196.
［6］ Sugino N, Telleria CM. Differntial regulation of copperzinc superoxide dismutase and manganese superoxide dismutase in the rat corpus luteum induction of manganese superoxide dismutase messenger ribonucleic acid by inflammafory cytokines ［J］. Biol Reprod, 1998,59: 599-605.
