甲状腺球蛋白基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

                作者：张进安，买尔哈巴，于志云，肖婉霞，王宇

【关键词】  自身免疫性甲状腺疾病;,,Graves病;,,桥本氏甲状腺炎;,,甲状腺球蛋白；单核苷酸多态性

   【Abstract】 AIM: To identify the presence of previously reported thyroglobulin (Tg) gene singlenucleotide polymorphism (SNP) in Chinese people and to investigate their potential relation to the aetiology of autoimmune thyroid disease (AITD). METHODS: In 228 patients with AITD ［146 with Greaves disease (GD) and 82 with Hashimotos thyroiditis (HT)］ and 131 normal Chinese subjects, PCRRFLP was used to determine the SNPs of exon 10, 12 and 33. RESULTS: Four reported exonic SNPs of Tg genes E10SNP24 T/G, E10SNP158 T/C, E12SNP A/G and E33SNP C/T were confirmed in Chinese population. No differences in allele and genotype frequencies of four SNPs were observed between AITD cases and controls or when GD or HT was analyzed alone. Strong linkage disequilibrium (LD) between E10SNP24 and E10SNP158 (D′=0.96) and a weak LD between E12SNP with E10SNP24 and E10SNP158 (D′=0.73, D′=0.74, respectively) were found. Furthermore, the combination of C allele of the exon 33 with three SNPs of exon1012 cluster (AGC) was found to be associated with HT (OR=3.06, P<0.01). CONCLUSION: This study not only confirmed the common Tg gene variants in Chinese people, but also demonstrated that some SNPs within Tg gene played a causal role for HT.

   【Keywords】 AITD; GD; HT; thyroglobulin; SNP

   【摘要】 目的: 检测人甲状腺球蛋白（Tg）基因的外显子10,12,33是否存在单核苷酸多态性(SNP)，研究其与自身免疫性甲状腺疾病（AITD）的关系. 方法: 对228例AITD患者［其中Greaves病（GD）146例，桥本甲状腺炎（HT）82例］和131例健康对照者采用PCRRFLP方法检测Tg基因外显子10,12和33的SNPs. 结果: ①Tg基因存在E10SNP24 T/G, E10SNP158 T/C，分别为E12SNP A/G和E33SNP C/T多态性位点. ②四个位点基因型及等位基因频率在AITD组或GD亚组或HT亚组与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05). ③E10SNP24与E10SNP158，E12SNP与E10SNP24, E12SNP与E10SNP158之间存在连锁不平衡，D′值分别为0.96, 0.73和0.74. ④HT患者的E33SNP为C等位基因时，E12SNP A，E10SNP24 G和E10SNP158 C在同一染色单体的基因频率显著多于对照组（P<0.01, OR=3.06）. 结论：中国北方汉族人存在Tg基因外显子10,12和33的单核苷酸多态性（SNP），且证实Tg基因与此类人群HT的发病有关.

   【关键词】 自身免疫性甲状腺疾病;  Graves病;  桥本氏甲状腺炎;  甲状腺球蛋白；单核苷酸多态性

    0引言

   Graves病（Graves disease, GD）及桥本氏甲状腺炎（Hashimotos thyroiditis, HT）是自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)的主要临床病理类型. 遗传因素在AITD的发生中起重要作用. 二十余年来的研究尚未证实甲状腺过氧化物酶基因、促甲状腺激素受体基因为AITD的易感基因［1-2］. 有关甲状腺球蛋白（thyroglobulin, Tg）基因与AITD相关性的研究国外仅有较少报道，来自不同人群的结论也不一致，在美国白人中发现的Tg基因与AITD的相关性在英国高加索人和日本人中并不存在［3-5］，因此我们首先就Tg基因与中国北方汉人AITD的相关性进行了研究.

   1材料和方法

   1.1材料实验组为在西安大学第一附属内分泌专科门诊收集的AITD患者228（男48，女180）例，年龄36.7±14.2岁. 其中GD 146 (男32，女114)例，年龄37.6±14.4岁；HT 82 (男16，女66) 例，年龄35.5±13.8岁. GD和HT的诊断依据为典型的临床表现和实验室检查. 对照组为按AITD患者的年龄分布、性别构成随机选取的西安交通大学第一附属医院查体中心的健康人131（男30，女101）例,年龄34.6±13.3岁. 离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒与PCR扩增试剂盒2×Taq PCR Masterix购自北京天为时代公司；限制性内切酶HpyCH4Ⅲ, BsaA I, BlpⅠ均购自纽英伦生物技术有限公司；AvaⅠ购自宝生物工程有限公司；引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成.

   1.2方法

   1.2.1外周血基因组DNA的提取清晨空腹静脉血EDTA抗凝，提取外周血基因组DNA.

   1.2.2PCR和酶切分析在NCBI网站GenBank中找到甲状腺球蛋白外显子10，12和33的基因序列，按［4］报道的三个外显子的突变区域，用PRIMER 5.0引物设计软件进行引物设计. 外显子33的上游引物序列为5′ATC CAC TCA TGC ATA TTG ACC A3′；下游引物为5′AGC CAT GTC TCA GCT ACC ACA3′. 外显子12的上游引物为5′TAC TGT GCA AGG AGC CTT TGT3′；下游引物为5′GGC TGG TAG AAG TTT CCT GCT3′. 外显子10的上游引物为5′CTG CAG TGC TGA TCA CCA ACT3′；下游引物为5′ATC TTC ACT AGC AGC TTG GCA3′.

   PCR反应体系均为25 μL, 含2×Taq PCR Masterix 12.5 μL ，上下游引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL. 限制性内切酶酶切反应总体积均为20 μL，不同的酶在反应体系液中的浓度按说明书加入，37℃水浴孵育过夜.

   统计学处理：读取个体样本，各组基因型及等位基因的频率，采用SPSS 11.5软件行统计学处理，对组间计数资料显著性检验用行列表χ2检验，对不符合四格表χ2检验的数据，进行Fisher确切概率法分析. 用NCBI官方网站提供的SHEsis在线计算平台［6］，计算LD值. 进行单体型分析，计算OR值.

   2结果

   2.1PCR及酶切反应外显子33 PCR扩增片段长度为411 bp. 以HpyCH4Ⅲ酶切后，E33SNP的TT基因型在凝胶上得到275 bp, 136 bp两个片断；杂合型TC得到275, 180, 136, 95 bp四个片段(图1).

   1,6~7:杂合基因型TC酶切产物; 2~4,8~9:纯合基因型TT酶切产物; 5:DNA marker.

   图1外显子33酶切图

   外显子12 PCR扩增片段长度为494 bp. 以BsaAⅠ酶切后，E12SNP的AA基因型得到401 bp, 93 bp两个片断；GG基因型得到248, 153, 93 bp三个片断；而杂合型TC得到401, 248, 153, 93 bp四个片段(图2).

   1,3:杂合基因型AG酶切产物; 2:纯合基因型AA酶切产物;4~6,8:纯合基因型GG酶切产物; 7:DNA marker.

   图2外显子12酶切图

   外显子10 PCR扩增片段长度为452 bp. 以BlpⅠ酶切后E10SNP24位点GG基因型得到237 bp，215 bp两个片断；杂合型TG得到452，237，215 bp三个片段(图3). 以AvaⅠ酶切后，E10SNP158位点为CC基因型时得到368 bp，84 bp两个片断; 杂合型TC得到452，368，84 bp三个片段(图4).

   1,3,5~6:杂合基因型TG酶切产物; 2:纯合基因型GG酶切产物; 4: DNA marker.

   图3外显子10 E10SNP24位点酶切图

   1~2:杂合基因型TC酶切产物;3,5~7:纯合基因型CC酶切产物; 4: DNA marker.

   图4外显子10 E10SNP158位点酶切图

   2.2各组间各个位点的基因型及等位基因分布频率比较AITD组与正常组之间，GD组及HT组与正常组之间，各组内男性与女性之间，4个位点基因型及等位基因频率的差异无统计学意义(P＞0.05). 按性别分层后，各病例组与正常组相同性别之间等位基因及基因型分布频率的差异无统计学意义(表1，P＞0.01).表1AITD组与正常组各个位点的等位基因及基因型的分布频率

   2.3连锁不平衡分析对四个位点进行连锁不平衡分析发现，E10SNP10与E10SNP158之间有较强的连锁不平衡，其D′值为0.96，r2=0.91, E12SNP与E10SNP24，E12SNP与E10SNP158间也达到了有意义的连锁不平衡，D′值分别为0.73，0.74；r2值分别为0.46, 0.46.

   2.4单体型遗传分析对四个位点进行单体型遗传分析，发现了6种通常出现的单体型，以E33SNP，E12SNP，E10SNP24，E10SNP158为顺序，其分别为CATT, CAGC, CGTT, CGGC,TATT, TGGC. 此6种单体型在AITD组与正常组，GD组与正常组之间的分布差异无统计学意义(P＞0.05). 在HT组发现，无论E33SNP位点为何种等位基因，其他三个位点为AGC单体型的频率增加，当E33SNP位点为C等位基因时，与其他三个位点共组成单体型CAGC的频率在HT组与正常对照组间的差异具有统计学意义（P<0.01,OR=3.06, OR的95%可信区间为［1.33~7.09］）(表2).表2桥本式甲状腺炎组的单体型分析

   3讨论

   全基因扫描及连锁分析在日本人群及高加索人群中证实Tg基因与AITD连锁并与其相关［7-8］； 尽管在美国高加索人种和英国高加索人种中均发现E10SNP24T/G, E10SNP158T/C, E12SNPA/G, E33SNPC/T四个基因多态性位点，但是病例对照研究却得到不同的结论. 我们的研究在北方汉族人群中证实了上述4个位点存在基因多态性，但是，我们发现中国人群上述四个等位基因与基因型的分布频率与高加索人种各等位基因及基因型的分布频率具有显著性差异. 以外显子33为例，中国正常人群此位点C等位基因频率为76.9%，基因型以CC为主，频率为61.3%，而高加索人种此位点C等位基因频率为53.9%，基因型以TC为主，频率大于45%［4-5］,  这就证实了不同种族的基因多态性不同.  同时，我们还发现CAGC单体型在HT组出现的频率显著多于正常对照组，因此我们认为Tg基因在中国北方汉族人群中与HT具有相关性. 我们的研究初步证实在中国北方汉族人中Tg基因是HT的相关基因.

   【】

   ［1］ De Rous N, Shields DC, Misrahi M, et al. Analysis of the thyrotropin receptor as a candidate gene in familial Graves disease ［J］. Clin Endocrinol Metab, 1996, 81(10): 3483-3486.

   ［2］ Okosieme OE, Parkes AB, Premawardhana LD, et al. Thyroglobulin: Current aspects of its role in autoimmune thyroid disease and thyroid cancer ［J］. Minerva Med, 2003, 94(5): 319-330.

   ［3］ Ban Y, Greenberg DA, Concepcion E, et al. Amino acid substitutions in the thyroglobulin gene are associated with susceptibility to human and murine autoimmune thyroid disease［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(25):15119-15124.

   ［4］ Collins JE, Heward JM, Howson M. Common allelic variants of exons 10, 12, and 33 of the thyroglobulin gene are not associated with autoimmune thyroid disease in the United Kingdom ［J］. Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(12): 6336-6339.

   ［5］ Ban Y, Tozaki T, Taniyama M,et al. Association of a thyroglobulin gene polymorphism with Hashimotos thyroiditis in the Japanese population［J］. Clin Endocrinol (Oxf), 2004, 61(2):263-268.

   ［6］ Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci ［P］. Cell Res, 2005, 15(2): 97-98.

   ［7］ Sakai K, Shirasawa S, Ishikawa N, et al. Identification of susceptibility loci for autoimmune thyroid disease to 5q31q33 and Hashimotos thyroiditis to 8q23q24 by multipoint affected sibpair linkage analysis in Japanese ［J］. Hum Mol Genet, 2001, 10(13):1379-1386.

   ［8］ Tomer Y, Greenberg DA, Conception E, et al. Thyroglobulin is a specific gene for the familial autoimmune thyroid disease ［J］. Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(7): 404-407.