轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定
【关键词】 轮状病毒；,VP6基因；基因,合成；,基因工程疫苗
【Abstract】 AIM: To design and obtain novel rotavirus (RV) VP6 gene. METHODS: On the basis of our previous reports, RV VP6 gene was optimized through the gradual splicing method, according to the improved PCR strategy. RESULTS: The optimized cDNA sequence of RV VP6 gene was successfully synthesized, which was about 1220 bp and reached 55% in (G+C) content. CONCLUSION: The optimized RV VP6 gene was obviously increased about 20% in (G+C) content compared to wildtype RV VP6 gene. This study laid a further strong foundation for the development of novel oral rotavirus genetic engineering vaccine.
【Keywords】 rotavirus; VP6 gene; genes, synthetic; genetic engineering vaccine
【摘要】 目的：设计获得轮状病毒（RV）新型VP6基因. 方法：本研究在前期工作的基础上，对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究. 我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造. 结果：成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列，该序列长约1220 bp，(G+C)含量达55%. 结论：与野生型RV VP6基因相比，优化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了约20%，这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础.
【关键词】 轮状病毒； VP6基因；基因，合成； 基因工程疫苗
0引言
轮状病毒（rotavirus, RV）是引起全世界婴幼儿严重腹泻的重要病原,RV危害严重且无有效的手段［1］,根除RV感染的惟一途径是安全、有效的疫苗,这已成为一个全球性的公共医疗目标,是一项十分迫切而必要的工作［2-5］. A组RV血清型众多,VP6蛋白是其主要的组特异性抗原,有较强的抗原性和免疫原性,可诱导保护性免疫. 有研究表明,VP6蛋白的IgA mAb对RV感染具有免疫保护作用,肌注免疫VP6 DNA疫苗可产生较好的异源保护作用［6］,以VP6蛋白和黏膜佐剂免疫小鼠可诱导产生对鼠RV EDIM株的完全保护作用［7］. 根据我国RV的感染状况,本课题组的疫苗设计方案主要包括A组RV的VP6抗原和A组RV G1，G2和G3型3种不同的VP7抗原. 前期免疫效果研究结果表明,灌胃免疫组产生的RV特异性免疫反应较滴鼻组弱,推测可能与疫苗在胃肠道受到胃酸和消化酶的降解破坏作用,导致其表达量降低和免疫效果弱化有关. 据此，为了发展新型高效的口服RV基因工程疫苗,我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化合成研究,以期提高其(G+C)含量,可望增加其表达量和提高以其为目标抗原的RV疫苗的免疫效果.
1材料和方法
1.1材料PcDNAⅡ质粒,E.coli DH5α菌种和E.coli DH10B菌种均为本室保存. Agarose Gel DNA purification Kit, Pyrobest DNA polymerase,T4 DNA Ligase, 限制性DNA内切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV,XGal, IPTG, DNA Marker DL2000, dNTP mixture和Amp均为Takara产品；RNA酶为Sigma产品； 酵母提取物和胰蛋白胨为OXOID产品； PEG(4000)为Promega产品.
1.2方法
1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.
1.2.2RV VP6基因的优化合成根据RV VP6基因的氨基酸序列和人类细胞偏爱的密码子,重新设计了RV VP6基因的重组cDNA序列,合成了引物P11～P116和P21～P216与sP115和sP216. 根据嵌套式PCR方法制备突变体的原理［8］,我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重组cDNA序列.
2结果
2.1RV VP6基因S1和S2片段的合成应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重组cDNA序列，RV VP6基因全长S片段分为S1和S2片段两部分先分别合成,再以S1和S2片段为模板，合成RV VP6基因全长S片段，合成策略见图1，2. 获得RV VP6基因S1和S2片段（图3，4），对其进行酶切和测序鉴定（图5，6），合成片段序列正确.
2.2获得优化的RV VP6基因全长S片段逐步拼接法获得了约1220 bp的RV VP6基因全长目的片段（图7）,进行酶切（图8）和测序鉴定,目的片段序列正确.
1: RV VP6基因全长S片段；2: DNA标准DL2000.
图7RV VP6基因全长S片段的PCR产物
1: DNA标准DL2000；2: RV VP6基因全长S片段阳性重组质粒.
图8RV VP6基因全长S片段阳性重组质粒酶切鉴定
2.3RV VP6基因优化改造前后的序列对比分析应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法成功地优化合成了RV VP6基因. 与优化改造前的野生型序列相比,优化后的RV VP6基因(G+C)含量提高了约20％. 优化改造前后的序列对比和(G+C)含量分析见表1.表1RV VP6基因优化改造前后的序列对比分析
3讨论
国内外新型病毒疫苗规划将RV预防性疫苗列为新型病毒疫苗研制的重点项目之一,全球疫苗与免疫接种联盟（GAVI）和WHO也十分重视的口服RV活疫苗,将其列为“全球疫苗腹泻病控制和免疫规划”主攻发展的首要疫苗. 为了发展新型高效的口服RV基因工程疫苗, 本研究在前期免疫效果研究工作的基础上, 针对灌胃免疫组产生的RV特异性免疫反应比滴鼻组弱的问题,分析其原因可能与疫苗在胃肠道受到胃酸和消化酶的降解破坏作用,导致其表达量降低和免疫原性弱化有关，根据有关HIV和DNA序列化学合成的有关研究报道［9-17］,提高目的基因的(G+C)含量可显著提高其表达量,从而增强其免疫效果. 据此,我们对RV VP6基因优化合成方法进行了探索研究. 根据RV VP6基因的氨基酸序列和人类细胞偏爱的密码子，我们重新设计了RV VP6基因的cDNA序列，并增加了有助序列正确翻译的Kozak序列，以提高VP6的表达量. 优化改造的VP6基因重组cDNA序列包含保护性碱基、酶切位点和Kozak序列，共计约1220 bp.
应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因的人工合成方法进行探索,我们发现应用改良的嵌套式PCR策略合成基因时,具体合成方法（逐步拼接法或两步法）的选择及基因合成的成功率可能主要取决于引物长度及其彼此间的重叠长度. ①当引物长度<60 bp,彼此间重叠长度<20 bp时,应用逐步拼接法可高效、准确和较地合成目的基因；在这种情况下应用两步法不易成功,因为引物数较多,彼此间结合不很牢固,而且很难达到一个恰当的共同退火温度,阻碍片段的顺利延伸. ②当引物长度≥60 bp,彼此间重叠长度≥20 bp时,应用两步法可快速、经济、有效地合成目的基因；在这种情况下应用逐步拼接法也很易成功,但合成所用时间要比两步法长,因此两步法是更理想的选择. 逐步拼接法的一个缺点在于其比两步法合成所用时间长,但两步法的缺陷在于一旦发生突变不利于查找和弥补. 因此,在适当的条件下,两种方法可以互补长短,以便简单、快速、高效、准确、经济地合成目的基因序列. 改良的嵌套式PCR策略是一种比较成功的基因合成策略. 该策略比较灵活，可根据引物长度和其彼此间的重叠长度，通过逐步拼接法或两步法合成基因，也可根据基因合成的实际情况将两种方法彼此结合起来应用，从而为改造基因、研究基因功能、结构和表达提供一种有力的工具.
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［1］ Parashar UD, Bresee JS, Gentsch JR, et al. Rotavirus ［J］.Emerg Infect Dis, 1998, 4:561-570.
［2］ Ward RL. Possible mechanisms of protection elicited by candidate rotavirus vaccines as determined with the adult mouse model［J］. Viral Immunol, 2003, 16(1):17-24.
［3］ 金奇. 医学分子病毒学［M］. 北京：出版社, 2001: 558-562.
［4］ Lynch M, Shieh WJ, Tatti K, et al. The pathology of rotavirusassociated deaths, using new molecular diagnostics ［J］. Clin Infect Dis, 2003, 37: 1327-1333.
［5］ Kapikian AZ. A rotavirus vaccine for prevention of severe diarrhea of infants and young children: Development, utilization and withdrawl［J］. Novartis Found Symp, 2001, 238: 153-179.
［6］ Yang KJ, Wang SX, Chang K, et al. Immune responses and protection obtained with rotavirus VP6 DNA vaccines given by intramuscular injection ［J］. Vaccine, 2001, 19:3285-3291.
［7］ Monica M, Mc Neal, John L, et al. CD4+ T cells are the only lymphocytes needed to protect mice against rotavirus shedding after intranasal immunization with a chimeric VP6 protein and the adjuvant LT(R192G) ［J］. J Virol, 2002, 2:560-568.
［8］ ［美］CM.迪芬巴赫,GS.德维克斯勒主编. 黄培堂,余炜源，陈添弥，等译. PCR技术实验指南［M］. 北京：科学出版社,1998:432-433.
［9］ Smith HO, Hutchison CA 3rd, Pfannkoch C, et al. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: PhiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(26):15440-15445.
［10］ Zhao X, Huo KK, Li YY. Synonymous codon usage in Pichia pastoris［J］. Shengwu Gongcheng Xuebao, 2000, 16(3):308-311.
［11］ Gao X, Yo P, Keith A, et al. Thermodynamically balanced insideout (TBIO) PCRbased gene synthesis: A novel method of primer design for highfidelity assembly of longer gene sequences ［J］. Nucleic Acids Res, 2003,31(22):e143.
［12］ David MH， Jacek L. DNA Works: An automated method for designing digonucleotides for PCRbased gene synthesis ［J］. Nucleic Acids Res, 2002, 30:e43.
［13］ Xiong AS, Peng RH, Li X, et al. Influence of signal peptide sequences on the expression of heterogeneous proteins in Pichia pastoris［J］. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao (Shanghai), 2003, 35(2):154-160.
［14］ Peng RH, Xiong AS, Li X, et al. PCRaided synthesis and stable expression in E.coli of the cryIA(c)Bt Gene［J］. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao (Shanghai), 2001, 33(2):219-224.
［15］ Peng RH, Xiong AS, Li X, et al. High expression of a heatstable phytase in Pichia pastoris［J］. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao (Shanghai), 2002, 34(6):725-730.
［16］ Peng R, Xiong A, Li X, et al. A deltaendotoxin encoded in Pseudomonas fluorescens displays a high degree of insecticidal activity ［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63(3):300-306.
［17］ Zha D, Eipper A, Reetz MT. Assembly of designed oligonucleotides as an efficient method for gene recombination: A new tool in directed evolution ［J］. Chem Biol, 2003, 4(1):34-39.
