SiRNA对大鼠钙调神经磷酸酶活性及VSMCs增殖的影响

             作者：林瑶，牛勃，解军，颜真

【关键词】  ,RNA干扰；神经肽Y；钙调神经磷酸酶；肌,平滑,血管/细胞学

　　Inhibitory effect of siRNA on calcineurin activity and vascular smooth muscle cell proliferation in rats

　　【Abstract】 AIM: To study the changes of calcineurin (CaN) activity and cfos expression level in the proliferation of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) stimulated by neuropeptide Y (NPY), and the inhibition of siRNA on the activity of CaN and the proliferation of VSMCs. METHODS: VSMCs from thoracic aorta in rats were cultured in vitro using tissuepiece anchorage primary culture. VSMCs were treated with NPY and the cell proliferation was observed. RNA interference (RNAi) was used to block CaNdepended signal transduction pathway in rat VSMCs stimulated by NPY, then the activity of CaN, the proliferation of VSMCs and the expression level of cfos were tested. RESULTS: NPY could increase the CaN activity,  the proliferation of VSMCs, and the expression level of cfos.  RNAi inhibited the activity of CaN, VSMCs proliferation and cfos expression in VSMCs. CONCLUSION: CaN takes part in the proliferation of cultured VSMCs stimulated by NPY, while RNAi blocks  the proliferation of VSMCs  stimulated by NPY by inhibiting the activity of CaN.

　　【Keywords】 RNA interference; neuropeptide Y; calcineurin; muscle, smooth, vascular/cytology

　　【摘要】目的： 观察神经肽Y(NPY)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中钙调神经磷酸酶（CaN）活性和cfos表达水平的变化，以及RNA干扰抑制CaN活性的作用. 方法： 采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞；NPY刺激培养的大鼠VSMCs增殖；RNA干扰特异性抑制CaN的活性及其mRNA的表达，阻断NPY刺激的大鼠VSMCs中CaN依赖的信号转导通路，观察对CaN活性、细胞增殖、核内原癌基因cfos表达水平的变化. 结果： NPY可增加VSMCs的CaN活性，加快细胞增殖及增加核内cfos表达水平. RNA干扰抑制CaN活性后，明显降低NPY刺激的VSMCs增殖及核内cfos表达水平. 结论： CaN参与了NPY刺激的VSMCs增殖，RNA干扰通过抑制CaN的活性可阻断NPY诱导的VSMCs增殖作用.
 
　　【关键词】 RNA干扰；神经肽Y；钙调神经磷酸酶；肌，平滑，血管/细胞学

　　0引言

　　钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)属丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，在细胞信号传递过程由Ca2+直接调节，具有去磷酸化作用. 目前认为，CaN是一种广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞、血管平滑肌和心血管内皮等组织细胞中，参与多种细胞功能［1］，心肌肥大、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和内皮细胞功能的调节［2］. Ca2+是调节VSMCs功能活动的重要信号传导递质，可介导多种神经体液因素、细胞因子等的信号传递，刺激核内多种原癌基因表达，进而激活增殖相关基因转录，促进细胞蛋白质合成，引起细胞增殖［3］. 但胞内Ca2+浓度变化与核内增殖基因活化的偶联机制尚不十分清楚. 我们采用细胞培养，RNA干扰，免疫组化等技术，探讨神经肽Y（neuropeptide Y, NPY)刺激VSMCs后的细胞增殖，细胞内CaN活性和cfos表达水平的变化，以及RNA干扰抑制CaN活性后，对NPY刺激的VSMCs增殖及CaN活性和核内cfos表达水平的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量(220±30) g，由第四军医大学实验动物中心提供；DMEM培养基干粉，胎牛血清(FBS)，牛血清白蛋白(BSA)均购于美国Gibco公司；对硝基磷酸酚，SMαactin抗体，TRITC标记山羊抗鼠免疫球，蛋白胰酶, NPY,MTT均购于美国Sigma公司；CaN测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；cfos免疫试剂盒购于北京中山生物技术有限公司；沉默基因TMU6 RNA干扰试剂盒为美国Promega公司产品.
 
　　1.2方法

　　1.2.1制备CaNAβmRNA的siRNA在GeneBank中查找CaNAβ mRNA序列（NO. BC114525）,根据该序列确定SiRNA的靶标序列，再参照该靶标序列的互补序列，设计siRNA的对照序列及其互补序列（应用Promega公司针对SilentgeneTM U6 Cassette RNA Interference System的特定siRNA设计软件，均为DNA引物,经过Blast基因同源性分析以保证其特异性）. 序列种类和其核苷酸序列见表1.

　　表1实验所用的序列种类及其核苷酸序列（略）

　　l.2.2大鼠主动脉平滑肌细胞培养SD大鼠颈动脉放血处死，无菌条件下，取大鼠胸主动脉，采用［4-5］的方法在含有抗生素(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)10 mL/L牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中，去除外周结缔组织及外膜，然后纵向剪开管腔，去除内皮，撕下中层平滑肌组织．剪成1 mm3左右大小，植入25 mL培养瓶中. 间隔1 mm2. 均匀分散平铺瓶底，放人37℃培养箱中，待组织块贴壁后，加入200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液静置培养. 10 d左右见有细胞从组织块边缘伸展，去除组织 块，换液，待20 d左右细胞融合成片，长满瓶底．用0.5 g/L胰酶加0.53 mmol/L EDTA的消化液，按常规方法消化. 制成细胞悬液，以3～5×108/L细胞密度分装入新的培养瓶进行传代培养. 2～3 d换液1次，5 d左右细胞长满瓶底，再次依法作传代培养. 所有实验采用第2～4代血管平滑肌细胞.
 
　　1.2.3VSMCs的培养及CaN活性和增殖活度的测定选择生长良好的VSMCs，胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5.0×107/L，接种于24孔板. 经24 h预培养，12 h, 10 mL/L血清培养液预处理后，随机分为4组，每组2个孔，重复3次： 对照组为细胞培养液，不加特殊处理因素；3个实验组分别加入含NPY(10-7, l0-6, l0-5 mol/L)的条件培养液. 继续培养24 h，收集细胞，加入冷生理盐水，反复冻融3次破碎细胞，离心取上清，应用考马斯亮兰法进行蛋白定量.
 
　　根据CaN测定试剂盒说明书，以钙调素作激活剂，对硝基磷酸酚(PNPP)为底物，用定磷法进行CaN活性测定. 定义每小时每毫克蛋白的CaN分解底物PNPP产生l μmol/L无机磷的量为一个CaN的活力单位，结果以比活力(μmol Pi/mgPr)表示. 调整VSMCs密度为5.0×107/L，接种于24孔培养板，每孔200 μL细胞悬液. 经24 h预培养，10 mL/L血清培养液预处理12 h后，随机分为4组,继续培养24 h后，采用快速自动微量MTT比色法测定VSMCs增殖活度值.
 
　　1.2.4siRNA对NPY刺激的VSMCs增殖的影响实验分组如下： 对照组不加特殊处理因素；NPY组更换含10-6 mol/L的条件培养液；NPY+siRNA组更换含10-6 mol/L NPY后，逐滴加入5 μL/孔的SilentgeneTM转染试剂,同时每孔加入4 μL预先混合的SilentgeneTM PCR产物,孵育48 h,然后进行检测. 采用MTT比色法测定VSMCs增殖活度值.

 
　　1.2.5siRNA对NPY刺激的VSMCs cfos表达的影响选择生长良好的VSMCs，消化接种于内置l cm2消毒盖玻片的培养瓶中，37℃, 50 mL/L CO2静置培养24 h，经12 h 10 mL/L血清培养液预处理后，随机分为对照组，NPY组和NPY+siRNA组，孵育48 h，终止培养. 小心取出盖玻片，PBS轻洗4次，常规冷丙酮固定l0 min, -20℃保存备用. 采用SP法，参照试剂盒说明书进行各组VSMCs的cfos免疫组化染色，阳性表达为细胞核呈棕黄色反应. 采用全自动HPLAS2000彩色病理免疫组化图像分析系统对各组阳性细胞片进行图像分析，每组4张细胞片，每张细胞片任选3个视野，统计其平均A值.
 
　　统计学处理： 实验数据均用x±s表示，SPSS11.0统计软件进行方差分析后，组间比较采用LSDt检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1VSMCs的形态学变化倒置相差显微镜下观察，培养出大鼠主动脉平滑肌细胞为梭形、长梭形，排列成放射状、旋涡状，呈典型“谷”与“峰”生长现象 (图1).

　　2.2NPY刺激的VSMCs的CaN活性和细胞增殖的变化不同浓度NPY(10-7, l0-6, l0-5 mol/L)刺激的VSMCs的CaN活性较对照组均有所增高. 10-7 mol/LNPY可明显提高VSMCs增殖活度(P<0.05)，且NPY促VSMCs增殖的作用随着浓度增高而更加显著（表2）.

　　A： 体外培养的VSMCs形态特征×20；B： 细胞呈αactin免疫阳性×40.
　　
　　图1大鼠主动脉平滑肌细胞的形态及其鉴定（略）

　　表2NPY刺激VSMCs的CaN活性和细胞增殖的变化（略）

　　aP<0.05 vs培养液对照.

　　2.3siRNA对NPY刺激的VSMCs增殖及cfos表达的影响结果显示NPY+siRNA组细胞增殖及cfos表达量较单纯NPY处理组显著降低(P<0.05). 提示siRNA可通过抑制CaN活性显著抑制NPY刺激的VSMCs增殖(表3).

　　表3siRNA对NPY刺激的VSMCs增殖及cfos表达的影响（略）

　　bP<0.05 vs对照; dP<0.05 vs 10-6 mol/L　NPY.

　　3讨论
 
　　NPY通过受体介导作用于VSMCs，使血管收缩、增强血管对缩血管物质的敏感性和刺激VSMCs的增殖［6-7］. 但有关NPY作用于VSMCs的信号传导机制，目前还较少有报道，且由于实验动物来源、血管种类的不同，NPY作用的观察结果差异较大，作用机制也不完全相同. 本实验观察到NPY促VSMCs增殖的作用随着浓度增高而增加. 不同浓度的NPY刺激的VSMCs后，细胞内的CaN活性较对照组均有所增高，而CaN介导的信号通路在VSMCs增殖过程中有着重要的调节作用［8-9］，提示NPY可能通过提高CaN的活性，激活CaN介导的信号通路从而诱导VSMCs的增殖.
   
　　本实验结果表明以DNA为载体的RNA干扰能够有效地引起细胞中内源性基因表达沉默,应用siRNA使其内部表达活跃的基因表达受到抑制［10-12］. 目前RNAi作为一种强有力的基因组分析工具应用于全世界各地的实验室，而且人们已经开始关注它是否可能作为一种极具潜力的特异性的性药物而应用于临床. 本研究针对CaN DNA 的1053～1071片段所设计的RNA干扰方案,发现siRNA可通过抑制CaN活性显著抑制NPY刺激的VSMCs增殖，推测CaN DNA的主要功能片段可能和该位置的序列有紧密联系,为今后进行基因研究或治疗提供.

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