eNOS基因转染对慢性缺氧性肺动脉高压的影响
【关键词】 高血压,肺性；基因疗法；一氧化氮合酶；重组,遗传；腺病毒科
Effect of adenovirusmediated human endothelial nitric oxide synthase gene transfer on chronic hypoxic pulmonary hypertension
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of adenovirusmediated human endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene(AdCMVceNOS) transfered to the rat lungs through airway on chronic hypoxic pulmonary hypertension(CHPH) rats and to explore its possible role in CHPH therapy. METHODS: Thirty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups(n=10 per group). the control group(group C), the chronic hypoxic group(group H), the chronic hypoxic and AdCMVceNOS transferred group(group T). The AdCMVceNOS (3×109 pfu) were tranfered into the rat lungs through the respiratory tract.Survey the pulmonary artery pressure(PAP), right ventricular weight and content of NO in pulmonary artery respectively after 3 d. The expression activity of eNOS was observed by immunohistochemistry and Western blot methods. RESULTS: The mean PAP and the RV/(LV+S) of group H and T increased obviously compared with group C (P<0.05); The mean PAP of group T decreased compared with group H (P<0.05); Compared with group C,the content of NO in group H decreased obviously (P<0.05), but group T was increased more obviously than group H (P<0.05). The A value of eNOS in group H and T increased obviously compared with that of group C (P<0.05), but the group T was significantly different from group H in A value (P<0.05). The levels of eNOS protein in group H (0.62±0.08) and T(0.92±0.17)were much higher than that in group C (0.30 ±0.05). CONCLUSION: Gene transfer of eNOS to the lung may be a useful therapeutic intervention for the treatment of CHPH, which may be correlated with the increased eNOS activity and NO content.
【Keywords】 hypertension, pulmonary; gene therapy; nitricoxide synthase; recombinatior, genetic; adenoviridae
【摘要】目的： 观察重组缺陷性腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因(AdCMVceNOS)对慢性缺氧性肺动脉高压大鼠的影响，探讨其可能的作用机制. 方法： 雄性Wistar大鼠30只，随机分为对照组（C组）、单纯慢性低氧组（H组）、慢性低氧+AdCMVceNOS转染组（T组），每组10只. 采用呼吸道转染途径，将3×109空斑形成单位的AdCMVceNOS转入大鼠肺脏. 3 d后测平均肺动脉压、右心室重量及肺动脉血NO含量，并采用免疫组化及Western blot方法观察内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达情况. 结果： H组及T组平均肺动脉压（mPAP）均较C组明显增加（P<0.05）；T组与H组比较mPAP降低（P<0.05）；H组及T组右心室重量/（左心室+室间隔）重量较C组增加（P<0.05）. H组与C组相比，其NO的含量明显降低（P<0.05），T组较H组显著增加（P<0.05）. H组及T组eNOS阳性表达强度(A值)较C组明显增加（P<0.05），而T 组与H组相比差异有统计学意义（P<0.05）. Western blot检测H组及T组肺组织eNOS含量分别为0.62±0.08和0.92±0.17，明显高于C组0.30±0.05. 结论： 外源性eNOS基因转染对大鼠慢性缺氧性肺动脉高压具有作用，该作用与其使eNOS活性增强及NO生成增加有关.
【关键词】 高血压，肺性；基因疗法；一氧化氮合酶；重组，遗传；腺病毒科
0引言
慢性缺氧性肺动脉高压(chronic hypoxic pulmonary hypertension, CHPH)是多种心肺疾病发生、的重要环节，亦是当今心血管外科围术期的难题之一［1］. 研究表明［2-3］，一氧化氮（nitric oxide, NO）生成减少在CHPH的发生中起重要的作用，而NO的合成，主要取决于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS）活性. 因此，对此类患者恢复eNOS/NO系统功能十分重要. 目前，外源性NO吸入已用于CHPH的治疗［4］，并取得显著的效果. 但吸入NO的消除半衰期短、机体易产生耐受性且有全身并发症，而使其应用受限. 若能将eNOS转基因重建NO功能，可能成为CHPH治疗的理想方法. 本研究应用重组缺陷性腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因(adenovirus carrying human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene with cytomegalovirus promoter, AdCMVceNOS)，通过气道转染途径进行转基因，观察AdCMVceNOS对CHPH大鼠的影响，探讨AdCMVceNOS对CHPH治疗作用的可能机制，为CHPH的防治提供新思路和新方法.
1材料和方法
1.1材料雄性Wistar大鼠30只，体质量210～260 g，由沈阳军区总实验动物中心提供；小鼠抗人eNOS mAb购自美国BD公司；SABC试剂盒购自北京中杉生物技术公司；NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AdCMVceNOS病毒DNA，由美国德克萨斯大学西南医学中心惠赠；S/5多功能生理记录仪芬兰Datex Ohmeda公司.
1.2方法
1.2.1重组腺病毒载体制备AdCMVceNOS病毒DNA用脂质体法体外转染293细胞，包装完整病毒颗粒并扩增. 经两次氯化铯密度梯度离心纯化及缓冲液透析后，应用TCID50法测定病毒滴度为1.99×1010 pfu/mL. 将病毒载体用病毒保存液，稀释成5×109 pfu/mL滴度备用.
1.2.2CHPH模型复制及动物处理Wistar大鼠随机分成3组： 对照组（C组），单纯慢性低氧组（H组），慢性低氧+AdCMVceNOS转染组（T组），每组10只. H组和T组大鼠置于常压低氧箱内，将氮氧混合气（900 mL/L氮气和100 mL/L氧气的混合气）通入低氧箱，箱内放置变色硅胶和无水氯化钙吸收CO2和水份. 在麻醉气体监测仪监测下，使O2浓度平衡在(10.0±0.5)%，CO2浓度为(3.0±0.5)%. 每天置入8 h，连续4 wk. C组除吸空气外，饲养条件与其他组相同.
1.2.3重组腺病毒的转染大鼠腹腔内注入100 g/L水合氯醛(35 mg/kg)和阿托品(0.2 mg/kg)麻醉，经口气管插管(14号塑料导管)行机械通气. 将大鼠头朝上直立，于呼气末用手按压胸廓尽力排出肺内气体，在松手同时用微量注射器迅速将AdCMVceNOS 50 μL注入T组大鼠气管内，继而注入空气200 μL使病毒均匀分布于各肺叶. 然后放平大鼠继续机械通气，间隔5 min重复该操作1次(共12次)，每只接受病毒载体总量为3×109 pfu. C组和H组只注入等容量病毒保存液，各组大鼠苏醒后拔出气管导管，单笼饲养3 d后待检.
1.2.4肺动脉压和右心室重量比大鼠腹腔注射水合氯醛(35 mg/kg)麻醉后，切开颈前右侧皮肤游离颈外静脉，将内径1 mm的聚乙烯导管充盈肝素盐水插入右颈外静脉，并缓慢将其推至右心室然后进入肺动脉. 导管外端连接压力转换器和生理多导仪，测平均肺动脉压(mPAP). 同时颈外动脉插管，接换能器记录仪，检测平均颈动脉压（mCAP）. 放血处死大鼠，迅速剪开胸腔取出心、肺. 右下肺置于40 g/L多聚甲醛（含1 g/L EPC）中固定，余肺置于液氮内冷冻待测. 剪去右心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称取右心室游离壁（RV）和左心室与室间隔（LV+S）质量，RV/(LV+S)质量比，作为右室肥大指标.
1.2.5肺动脉血NO含量测定实验前数日大鼠少食含氮食物，实验前空腹12 h以上. 测定mPAP后从肺动脉采血2 mL,采用硝酸还原酶法测定NO.
1.2.6免疫组织化学分析采用SABC法，标本分别滴加小鼠抗人eNOS mAb. 4℃冰箱过夜后，滴加生物素化山羊抗鼠抗体工作液，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30 min后行DAB显色及苏木素复染. 用PBS替换一抗，作阴性对照. 阳性反应为胞质内显棕褐色颗粒.
每张肺组织切片随机选取5个视野，用全自动图像分析仪检测eNOS阳性染色物质的平均吸光度值（A值 ）.
1.2.7eNOS的Western blot检测将-70℃保存的肺组织样品取出后融化，每份样品加入粉碎缓冲液300 μL (20 mmol/L TrisHCl pH 7.5, 0.25 mmol/L Sucrose pH 7.5, 10 mmol/L EGTA, 2 mmol/L EDTA)超声粉碎，取其上清液. 采用考马斯亮蓝定量法行蛋白定量. 取各组40 μg总蛋白上样于150 g/L SDSPAGE电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，转印膜在封闭液（50 g/L脱脂奶粉溶液）中封闭过夜. 加入一抗孵育2 h，洗膜后加入羊抗鼠辣根过氧化物酶标二抗，孵育2 h用TTBS洗2次，TBS洗1次. 增强化学发光剂 (enhanced chemiluminescence, ECL)A液和B液等量混合，按0.125 mL/cm2膜面积点于转印膜上，室温孵育1 min后倾掉ECL. 用保鲜膜覆盖并置暗盒中曝光40~60 s（可重复曝光），冲洗胶片. X线片扫描成像，经凝胶自动分析成像系统测定条带的吸光度值做定量分析.
统计学处理： 所有数据均以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件包，用方差分析进行分析处理. P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1mPAP, mCAP和右心室重量的变化结果显示： 各组mCAP相比无显著性差异(P>0.05)；H组及T组mPAP较C组明显增加(P<0.05)，T组mPAP较H组降低(P<0.05)；H组及T组RV/(LV+S)较C组增加(P<0.05，表1).
表1各组大鼠mCAP, mPAP和RV/(LV+S)的变化（略）
aP<0.05 vs C; bP<0.05 vs H.
2.2肺动脉血NO含量变化H组19.87±3.81与C组35.78±5.95比较，其NO的含量明显降低(P<0.05)，T组78.13±8.11较H组显著增加(P<0.05).
2.3NO对mPAP的影响mPAP在H组明显高于C组(P<0.05)，提示低氧后NO含量的降低引起了mPAP的升高. NO的含量在T组明显高于H组(P<0.05), mPAP在T组明显低于H组(P<0.05)，表明转染后NO含量增加引起了mPAP的下降.
2.4免疫组化染色大鼠气管、支气管上皮细胞，肺泡囊内细胞，肺中小血管的结缔组织细胞，内皮细胞均有大量eNOS转染(图1A). 对照组相应部位细胞，几乎无eNOS表达（图1B）.
A： AdCMVceNOS转染组；B： 对照组.
图1大鼠肺组织eNOS免疫组化染色SABC ×400（略）
2.5eNOS阳性表达产物图像分析H组0.19±0.04及T组0.36±0.05的eNOS阳性表达吸光度A值，均较C组0.15±0.02明显增加（P<0.05），T 组亦高于H组，有统计学意义（P<0.05）.
2.6Western blot检测各泳道上都有单一条带，分子量为在140 kb左右，用以反映eNOS的含量（图2）. 定量检测结果发现，H组及T组肺组织eNOS含量分别为0.62±0.08和0.92±0.17，明显高于C组0.30±0.05（P<0.05）.
M： marker；C： 对照组；H： 单纯慢性低氧组；T： 慢性低氧+AdCMVceNOS转染组.
图2大鼠肺组织eNOS蛋白印迹分析（略）
3讨论
内源性NO是由血管内皮细胞所生成的血管活性物质，对肺循环阻力的调节起重要作用. 业已证实［2］，肺血管床内皮细胞功能障碍导致NO生成减少，是CHPH发生的病理基础. 慢性低氧时NO合成释放减少且活性丧失，从而导致肺动脉高压.
eNOS是NO生成的主要限速酶之一，其活性与NO生成量呈正相关. 对eNOS基因敲除的研究表明［3］，eNOS源性NO在维持肺血管张力方面起重要作用. 然而，低氧时肺动脉血NO含量及eNOS变化趋势目前研究仍存在争议［5-6］. CHPH时NO减少的机制，尚未完全阐明. 有实验发现低氧抑制eNOS蛋白表达，使NO含量减少. 而晚近研究表明，低氧上调eNOS mRNA的表达. 本研究发现，慢性低氧可使血浆NO含量下降，但eNOS表达水平呈上调趋势. 究其原因，我们认为，NO作为NOS的产物，其底物为L精氨酸和NADPH. eNOS发挥作用需Ca2+参与，在其他底物和因子都存在的情况下，低氧可直接抑制eNOS活性及NO产生. 慢性低氧时虽然eNOS表达升高，但其活性受抑制而致NO产生减少. 其可能的机制为eNOS/NO体系功能障碍，其中主要是eNOS发生质的异常，而致内源性NO生成不足.
据此我们推断，重建CHPH患者eNOS/NO功能对其具有重要意义. 目前NO吸入已成功地应用于CHPH的临床治疗［4］，并显示出高效、选择性舒张肺血管及改善氧合等优点. 但亦存在诸多难以解决的问题，如作用短暂、高铁血红蛋白血症、停药后易反弹以及全身并发症等，因而限制了NO吸入用于PAH的长期治疗［7］.
本研究以重组腺病毒作为载体，通过呼吸道转染途径将携带人类eNOS基因的重组腺病毒AdCMVceNOS转染CHPH大鼠取得成功. 经检测证实，转基因表达产物具有正常的酶学活性，使内源性NO含量显著增加. 且在不影响体循环压力的情况下使肺动脉压力明显降低，从而达到重建eNOS/NO功能及治疗肺动脉高压的目的. 我们推测其可能的机制是，AdCMVceNOS基因转染CHPH大鼠后，转基因表达产物使体内eNOS活性增强致NO生成增加. NO活化鸟苷酸环合酶致cGMP水平增高，继而激活PKG而引起一系列生物学效应. 并通过NOcGMP信号转导通路调节肺血管张力以及肺血管构型重建，从而降低了mPAP.
综上所述，重组缺陷性腺病毒介导的人类内皮型eNOS基因转染，对CHPH大鼠具有治疗作用，此可为肺动脉高压基因治疗的临床应用提供理论依据，但是要将这项技术运用于临床还需解决诸如基因表达持续时间，基因表达调控等问题.
【】
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