9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达
【关键词】 颗粒溶素；真核表达质粒；分泌表达
Construction and secreting expression of eukaryotic expression plasmid carrying human 9 kugranulysin gene
【Abstract】 AIM: To construct secreting eukaryotic expression plasmid carrying human 9 kugranulysin gene and to lay a foundation for the study of granulysin as antitumor gene therapy agent. METHODS: After amplified by PCR from the plasmid including granulysin complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), 9 kugranulysin gene fragment carrying leader peptide gene was cloned into pBudCE4.1 to construct recombinant plasmid pBudCE4.1S9K. Identification of pBudCE4.1S9K was conducted by PCR , restriction enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into RAW264.7 cells, and its transient expression was detected by RT PCR, immunocytochemistry and DotELISA. RESULTS: 9 kugranulysin gene fragment including leader peptide gene was obtained ; it was confirmed that gene was inserted into eukaryotic expression plasmid correctly; 9 kugranulusin can be expressed and secreted in transfected cells. CONCLUSION: Eukaryotic expression plasmid pBudCE4.1S9K carrying human 9 kugranulysin gene was constructed successfully.
【Keywords】 granulysin; eukaryotic expression plasmid; secreting expression
【摘要】 目的： 构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素（granulysin）的真核质粒，为下一步利用颗粒溶素基因肿瘤奠定基础. 方法： 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后，定向插入真核表达载体pBudCE4.1中，获得重组表达质粒pBudCE4.1S9K，通过PCR，双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定；采用RTPCR，免疫细胞化学与DotELISA法检测pBudCE4.1S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌. 结果: 成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段；经酶切，PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒；转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素. 结论: 成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1S9K.
【关键词】 颗粒溶素；真核表达质粒；分泌表达
0引言
肿瘤是一类严重影响人们身体健康和生活质量的疾病. 肿瘤的基因治疗是继手术、化疗和放疗之后出现的一种新型治疗手段，已成为抗肿瘤研究的热点. 颗粒溶素是人体NK，CTL细胞产生的一种具有抗菌、抗肿瘤的免疫效应分子［1］，含15 ku的前体形式和9 ku的活性形式. 重组的9 ku颗粒溶素可引起多种肿瘤细胞凋亡. 但由于抗菌的作用，采用基因工程方法获得大量的活性颗粒溶素分子比较困难，限制了其的直接应用. 目前国内外应用9 ku颗粒溶素在体内进行肿瘤基因治疗的相关报道也较少. 本研究旨在构建9 ku形式的颗粒溶素真核表达质粒，并加上15 ku的分泌肽cDNA序列，以期分泌表达，为下一步应用肿瘤靶向载体携带颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.
1材料和方法
1.1材料RAW264.7细胞，E.coli TOPl0为重庆医科大学免疫学与微生物学教研室保存；多启动子共表达载体pBudCE4.1购自美国Invitrogen公司；含9 ku颗粒溶素的cDNA质粒pZM03由重庆医科大学免疫学与微生物学教研室构建［2］；RNA提取试剂盒，cDNA逆转录试剂盒，琼脂糖等均购自上海生工；rTaq酶，Pyobest酶，限制性内切酶，快速连接试剂盒均购自大连宝生物公司；质粒纯化抽提，胶回收，PCR产物纯化试剂盒均购自上海华舜生物公司；RPMI 1640培养液和胎牛血清购自重庆惠利生物技术公司（Hyclone公司产品）；LipofectamineTM 2000购自重庆百瑞生物技术公司（Invitrogen公司产品）；抗颗粒溶素兔IgG抗体购自基因公司（美国SANTA CRUZ生物技术公司产品）；DAB显色试剂盒，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德生物技术有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自北方同正生物技术公司.
1.2方法
1.2.1pBudCE4.1S9K质粒的构建根据基因库中的人颗粒溶素编码序列(登录号：NM_006433)，将颗粒溶素15 ku前体分子的分泌肽基因45 bp［1］与9 ku活性片段(222 bp)的cDNA的N端23 bp共68 bp设计为引物P1，P1：ATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCGGCCGTGACTACAGGACCTGTCT. 再根据带分泌肽的9 ku的cDNA序列（共267 bp）分别设计引物P2，P3分别含有HindIII和BamH I 酶切位点，引物P2： 5′ATAAGCTTACCATGGCTACCTGGGCCCTCCTGC3′，插入HindIII酶切位点，同时添加ACC，使ATG位于ACCATGG的KOZAK序列中（有利于真核细胞蛋白翻译起始）；引物P3：5′AGGGATCCTCACCTGAGGTCCTCACAGATCTGCTGG3′，插入BamHI 酶切位点和终止密码对应序列. 以pZM03为模板PCR扩增含分泌肽的9 ku基因片段，反应体系：10 × buffer 5 μL， 2.5 × dNTP 8 μL， Pl， P2各0.5 μL， P3 1 μL, Probest酶0.5 μL, 模板1 μL，灭菌去离子水33.5 μL，共50 μL；扩增条件：94℃ 3 min; 94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，共30循环；72℃ 5 min. 扩增产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测. 用HindIII/BamH I酶切PCR产物，并用相应的酶消化载体质粒pBudCE4.1，回收目的DNA片段. 根据连接试剂盒说明操作，将分泌型9 ku活性片段基因定向克隆进载体质粒pBudCE4.1中，构建含分泌肽基因片段的重组9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1S9K. 将重组质粒转化感受态E.coli TOPl0，然后在含Zeocin抗生素的低盐LB培养基进行筛选. 抽提重组质粒酶切鉴定，并送博亚生物技术公司测序鉴定.
1.2.2细胞转染RAW264.7细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基生长至80％汇片，用重组pBudCE4.1S9K质粒进行转染，以pBudCE4.1空质粒和未转染细胞作为对照. 转染试剂为脂质体(LipofectamineTM 2000)，具体方法参照转染试剂说明书进行.
1.2.3RTPCR分析转染细胞的表达产物分别于转染24 h收集实验孔及空质粒对照孔细胞提取总RNA进行逆转录,操作均根据试剂盒说明进行. 以各自的cDNA为模板，分别以P2，P3为引物按照上述条件进行PCR扩增.
1.2.4免疫细胞化学检测颗粒溶素蛋白分子表达将转染重组pBudCE4.1S9K质粒和pBudCE4.1空质粒48 h的24孔板中的细胞爬片取出，用PBS洗涤，40 g/L的多聚甲醛固定过夜. 用30 mL/L的H2O2 滴加在细胞爬片上处理10 min消除内源性的过氧化物酶. 正常羊血清封闭，滴加1∶100的兔抗颗粒溶素IgG抗体，再滴加1∶200的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体，用新鲜配制的DAB显色液显色，苏木素复染，脱色透明，中性树胶封片，观察.
1.2.5DotELISA检测颗粒溶素的分泌分别于72 h收集转染重组质粒的细胞培养上清液、转染空质粒的细胞培养上清液和正常未转染质粒的细胞培养上清. 用10 μL点NC膜，每样三点. 用50 g/L脱脂奶粉常规封闭1 h. PBS洗涤3次，每次5 min. 放入1∶400稀释的颗粒溶素抗体中反应1 h. PBS洗涤3次，每次5 min. 再放入1∶2000稀释的HRP标记的抗颗粒溶素抗体（二抗）反应30 min. PBS洗涤3次，每次5 min. 放入新鲜配制的DAB显色液中显色. 清水冲洗、摄相保存.
2结果
2.1目的基因的PCR扩增以Pl，P2，P3为引物PCR扩增得约267 bp大小的特异条带(9 ku的颗粒溶素活性片段cDNA 222 bp,分泌肽的DNA片段45 bp)(图 1).
1： DNA标准；2： 阴性对照；3： PCR产物.
图1含分泌肽基因的9 ku颗粒溶素基因的扩增（略）
2.2pBudCE4.1S9K质粒的构建将HindIII/BamHI酶切处理的PCR扩增产物与质粒pBudCE4.1的相应目的片段连接，构建重组质粒pBudCE4.1S9K. 重组质粒经筛选后，用HindIII/BamHI双酶切鉴定切出约267 bp目的片段. pBud CE4.1S9K测序结果表明基因未发生突变，基因序列与报道完全一致(图2).
1, 4: DNA标准；2: pBudCE4.1S9K用HindIII与/BamHI双酶切；3: pBudCE4.1S9K用HindIII单酶切.
图2 pBudCE4.1S9K的酶切鉴定（略）
2.3RTPCR 法分析pBudCE4.1S9K质粒在RAW264.7细胞中的表达采用RTPCR法在转染有pBudCE4.1S9K的RAW264.7细胞扩增出约267 bp目的DNA片段,而空质粒转染细胞无相应片段(图3).
1: DNA标准；2: 空质粒对照；3~4: pBudCE4.1S9K.
图3质粒转染RTPCR鉴定结果（略）
2.4免疫细胞化学法检查9 ku颗粒溶素的胞内表达分别用转染有pBudCE4.1S9K, pBudCE4.1空质粒的RAW264.7细胞爬片免疫细胞化学法检测，DAB显色. 转染重组质粒pBudCE4.1S9K的细胞胞质黄染，出现明显的棕黄色颗粒；而未转染的细胞和转染pBudCE4.1空质粒的细胞未见棕黄色颗粒，细胞蓝染（图4）.
2.5DotELISA检测颗粒溶素的分泌分别用转染质粒pBudCE4.1S9K, pBud CE4.1 72 h的细胞培养上清与未转染质粒的72 h的细胞培养上清在NC膜上点样，用DAB显色，可见转染质粒pBud CE4.1S9K组出现明显的斑点，而空质粒和无质粒组未见斑点出现（图5）.
A: 转染pBudCE4.1S9K;B: 转染pBudCE4.1.
图49 ku颗粒溶素的胞内表达免疫细胞化学结果DAB ×200（略）
1: 转染pBudCE4.1S9K；2: 转染空质粒；3: 未转染.
图5DotELISA法检测颗粒溶素表达（略）
3讨论
颗粒溶素是近年来新发现的具有抗肿瘤作用的免疫效应分子，其功能由9 ku活性形式发挥. 颗粒溶素诱导肿瘤细胞的凋亡机制主要通过调节细胞膜上鞘磷脂/神经酰胺的比例、活化半胱天冬酶、损伤线粒体及改变胞内Ca2+浓度来实现［3-6］. 我们选择9 ku颗粒溶素基因作为体内肿瘤基因的因子，一方面是基于颗粒溶素的抗肿瘤作用明确，体外实验显示重组的9 ku颗粒溶素对多种肿瘤细胞具有显著的凋亡诱导作用；另一方面是因为在肿瘤患者，尤其是进展期肿瘤颗粒溶素的水平大大降低［7］. 可通过改善机体的颗粒溶素水平，调节细胞免疫功能来增强机体的抗肿瘤能力.
目前的基因治疗基本只对转染的细胞起作用，对未转染的细胞作用甚微. 我们通过设计分泌肽基因，使9 ku颗粒溶素不但能在胞内表达，而且还会分泌到胞外. 这样，不但可使抗肿瘤效应扩大，避免只针对转染治疗基因的肿瘤细胞起作用的不足；而且还可以通过颗粒溶素的趋化作用激发免疫系统发挥协同抗肿瘤的效应［8］.
完整的颗粒溶素基因已在本实验室成功克隆，并在真核细胞中高效表达［9］. 本实验通过设计相应引物，添加分泌肽编码基因，成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku颗粒溶素基因片段. 将该片段定向克隆入真核表达质粒构建重组质粒，插入序列正确. 多种方法证实，9 ku颗粒溶素分子可在真核细胞表达并分泌. 颗粒溶素真核表达质粒的成功构建，为下一步进行功能鉴定和采用肿瘤靶向载体将颗粒溶素基因运送到肿瘤组织治疗肿瘤奠定了基础.
【文献】
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