间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析

【关键词】  蛋白质组学；间质干细胞；蛋白表达

　　Proteomic analysis of human bone marrowderived mesenchymal stem cells induced to differentiate into osteoblasts

　　【Abstract】 AIM: To analyze the difference of protein profiles between human bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and osteogenic differentiated MSCs by proteomic approach. METHODS: The MSCs were isolated primarily from bone marrow of adults and detected in cell purity by flow cytometry analyzing cell phenotypes and in cell function by multilineage potential test. The undifferentiated MSCs and osteogenic differentiated MSCs over a period of 14 d were collected and cell total proteins were extracted for finding out the differential expression by proteomic analysis including 2D gel electrophoresis and Peptide Mass Fingerprinting technology. RESULTS: Twentythree differentially expressed proteins were identified by MALDITOFMS analysis. CONCLUSION: Proteomic approach is a high throughput method to screen the key proteins which play important roles in MSCs osteogenic differentiation.

　　【Keywords】 proteomics; mesenchymal stem cells; protein expression

　　【摘要】 目的: 探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞（MSCs）定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs，经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨细胞分化诱导培养体系，于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白，双向电泳分析，确定蛋白差异点，经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点，质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.

　　【关键词】 蛋白质组学；间质干细胞；蛋白表达

　　0引言

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一群具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化能力的干细胞，存在于成体的骨髓、骨、脂肪和肌肉等组织中. MSCs体外贴壁性使之易于分离纯化，且体外培养的MSCs增殖能力强，是一种具有重要应用价值的种子细胞［1］. 但有关MSCs定向分化的分子机制尚不清楚. 为探讨MSCs定向成骨分化过程中细胞内可能具有调控作用的蛋白分子的变化，我们首先从人骨髓单个核细胞中分离获得MSCs，对所获得的MSCs进行了细胞表型及多向分化能力测定，在鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨分化诱导培养体系诱导MSCs定向成骨细胞分化，对未分化MSCs及分化后细胞总蛋白进行提取，经双向电泳比较蛋白差异点，选择差异点蛋白，酶切后进行蛋白点肽质量指纹谱鉴定分析.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　骨髓取自食道癌手术患者，年龄56～67岁. 主要试剂Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）培养基为Gibco产品，胎牛血清为Stem cell产品，Percoll为Amersham Pharmacia产品，CD34，CD45，CD73，CD105，CD166单克隆抗体为BD公司产品，胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸钠、抗坏血酸、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色试剂盒、CHAPS为Sigma产品，IPG干胶条(pH310,18 cm)为Amersham Pharmacia产品，碘乙酰胺为Fluka产品，标准蛋白BSA为Pierce产品，其他试剂由本室提供.

　　1.2方法

　　1.2.1人骨髓MSCs的分离培养Percoll分离人骨髓单个核细胞，2×105细胞/cm2密度接种于塑料培养瓶中，培养体系为含100 mL/L经筛选胎牛血清的高糖DMEM，48 h后去除非贴壁细胞，每隔3 d换液，至贴壁细胞0.80融合时按3000细胞/cm2接种传代.

　　1.2.2人骨髓MSCs的鉴定收集3代以后的细胞，按1 μL/1×106细胞分别加入PE或FITC直接标记的抗CD34，CD45，CD73，CD105和CD166等单克隆抗体，室温反应20 min. PBS洗涤后,流式细胞仪检测,每个反应至少收集5000个点数据. 以加入相应同型抗体细胞作为阴性对照，应用相关软件分析［2-3］. 按照方法［4］诱导MSCs向成骨细胞分化，用ALP染色鉴定；诱导MSCs向脂肪细胞分化，用油红染色鉴定；诱导MSCs向成软骨细胞分化，阿尔辛蓝染色鉴定.

　　1.2.3双向电泳

　　1.2.3.1双向电泳蛋白质样品的制备收集3代以后的MSCs和向成骨诱导分化的细胞，用冷的PBS洗2遍后，加入细胞裂解液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris base)，混匀后用液氮反复冻融，再加入适量RNA酶和DNA酶，冰浴20 min. 4℃离心(14 000 g,30 min)，取上清，Bradford法定量，分装，-70℃保存.

　　1.2.3.2第一向固相PH梯度等电聚焦（IEF）100 μg（银染）或1 mg（考染）蛋白与重泡涨液（8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，5 μL/L IPG缓冲液，20 mmol/L DTT，痕量溴酚蓝）混合，行等电聚焦，重泡涨与等电聚焦在16℃，以设定程序进行，总电压时间为80 000 V・h.

　　1.2.3.3平衡等电聚焦结束后，每根IPG胶条用8 mL含SDS的平衡液（50 mmol/L Tris・Cl (pH 8.8)，6 mmol/L尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，痕量溴酚蓝）平衡两次，每次15 min，第一次为还原过程，平衡液内加20 mmol/L DTT；第二次平衡为烷基化过程，平衡液内加100 mmol/L的碘乙酰胺.

　　1.2.3.4第二向垂直平板电泳（SDSPAGE）将平衡好的IPG胶条转移至130 mL/L的丙烯酰胺胶上分离，碱性端旁置蛋白分子量Marker，行SDSPAGE.

　　1.2.3.5染色及凝胶图像采集分析SDSPAGE胶在硝酸银染色时须经过固定、增敏、显色三步；在考马斯亮蓝染色时，则须染色3 h，然后脱色. 染色后的双向电泳凝胶用凝胶图像扫描仪透射扫描，数字化图象文件采用Amersham Pharmacia公司的二维电泳处理软件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，结合目视，从分子量、等电点等方面比对蛋白分子差异点.

　　1.2.4蛋白点肽质量指纹谱鉴定

　　1.2.4.1切胶、脱色、干燥将电泳后凝胶中蛋白质点切出，用干净的解剖刀将胶块切成约1～2 mm3大小，去离子水冲洗，除尽残留的SDS. 用含500 mL/L乙腈、25 mmol/L NH3HCO3的溶液100～200 μL,涡旋混合器震荡约30 min,重复此操作直至胶块中的蓝色完全褪尽. 将胶块在真空干燥器内干燥约20 min.

　　1.2.4.2酶切及肽段提取在干燥好的胶块上加入3～7 μL胰蛋白酶液（0.01 g/L,配于25 mmol/L NH4HCO3溶液内），4℃放置15 min使酶液完全被吸收，补加5 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液保湿，37℃温育18～20 h. 收集酶切后的上清，在胶块内加50～100 μL 50 g/L三氟乙酸于40℃放置1 h，收集上清；再加入25 g/L三氟乙酸、500 mL/L乙腈50～100 μL于30℃放置1 h，收集上清；合并上清液离心干燥.
1.2.4.3肽混合物的PMF分析在干燥后的肽混合物内加入3～7 μL 50 g/L三氟乙酸，混匀后，取0.5～1 μL溶液和等体积饱和基质溶液混合，然后加至不锈钢靶上，室温干燥，装靶测定：20 kV，阳离子模式下在Bruker REFLEX Ⅲ型MALDITOFMS(BrukerFranzen, Bremen, Germany)质谱仪上获取数据，用Mascot()软件在NCBInr数据库内进行检索.

　　2结果

　　2.1人骨髓MSCs形态骨髓单个核细胞于3 d左右开始伸出突起,2～6 d时细胞增殖较缓慢,逐渐长为梭形,7 d开始细胞增殖迅速,细胞呈旋涡状生长,14 d左右逐渐达到完全融合(图1).

　　2.2流式细胞学分析MSCs表型研究表明,MSCs具有多种标志分子,有造血干细胞生长因子及间质细胞、基质细胞抗原和细胞外基质受体的表达, 但并不表达CD45，CD34等造血干祖细胞的表面标志. 通过流式细胞学分析，培养的MSCs表达CD73，CD105，CD166，不表达CD34，CD45(图2).

　　2.3MSCs功能鉴定ALP染色鉴定MSCs向成骨诱导分化，ALP染色MSCs阴性，成骨细胞阳性；油红染色鉴定MSCs向成脂肪诱导分化，油红染色MSCs阴性，成脂肪细胞阳性，可见脂滴堆积；阿尔辛蓝染色鉴定MSCs向成软骨诱导分化，成软骨细胞阳性，存在大量蛋白聚糖基质. 通过MSCs表型和MSCs功能鉴定证实，我们获得了从人骨髓单个核细胞分离培养的MSCs细胞(图3).

　　2.4双向电泳显示蛋白质差异点的变化MSCs与成骨细胞凝胶图像存在多个蛋白差异点，选取38个差异点，切胶作质谱分析. 经过鉴定，共有23个差异点鉴定出差异蛋白(图4).

　　2.5质谱分析鉴定差异蛋白鉴定结果表明，大多数蛋白点的出峰情况较好［部分蛋白分子差异点的肽质量指纹谱（PMF），图5］. 用MALDITOF/MS结果进行检索就可以得到比较确定的鉴定结果. 质谱鉴定MSCs和向成骨诱导细胞蛋白差异点的详细情况见表1.表1质谱鉴定的差异蛋白（略）

　　3讨论

　　骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，研究证实MSCs可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞,MSCs还可分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、内皮细胞. 这些研究结果表明,间充质干细胞已超越了传统意义上只能分化为间质组织的概念. 细胞分化的实质是细胞内基因的选择性表达,导致细胞新的特异性的蛋白质的合成,从而在生化、结构及功能上发生变化. 对细胞内基因的结构与功能的研究最终需定位于细胞内蛋白质的结构与功能的研究. 因此我们应用蛋白质组学实验技术检测MSCs定向诱导分化为成骨细胞后蛋白表达的差异，期望发现对MSCs的诱导分化起作用的调控蛋白，从功能蛋白质组学的高度阐述MSCs分化过程中其相关蛋白质的含量与修饰的变化，以便更深入地阐明MSCs定向分化的分子机制. 我们经过筛选，从38个蛋白差异点中鉴定出23个差异蛋白. 在这些差异蛋白中，微管蛋白和骨架蛋白占相当大的比例，如Moesin，β微管蛋白、cofilin 1，平滑肌蛋白、SM22alpha. 由于MSCs诱导分化成成骨细胞，微管蛋白和骨架蛋白的表达必然增加. 我们也找到了2个感兴趣的差异蛋白：热休克蛋白27和KIAA0120. 热休克蛋白27是热休克蛋白家族中的一员，作为一种分子伴侣，它参与一系列细胞活动，包括细胞内蛋白聚集的抑制、细胞骨架蛋白的动力学、细胞生长与细胞分化等. 热休克蛋白27的诱导和表达与肌动蛋白和微管蛋白的结构建造紧密相连，通过磷酸化作用稳定细胞肌丝，从而在细胞保护方面发挥作用［5-6］. 近年来的研究证实，热休克蛋白27通过几种不同的机制参与细胞凋亡，有关热休克蛋白27参与细胞凋亡的信号传导通路已经成为这一领域研究的热点之一. 热休克蛋白27能维持细胞内氧化还原的动态平衡和线粒体的稳定，通过与细胞色素C的相互作用，调节细胞行使细胞凋亡功能［7］. 在以后的实验中，我们会围绕热休克蛋白27基因和蛋白作一些相关研究. 我们另一个感兴趣的差异蛋白是KIAA0120. KIAA0120是KIAA家族中的一员. 目前对KIAA的研究主要集中于基因水平，对KIAA蛋白的结构与功能所知不多［8-9］. 我们应用反转录PCR（RTPCR）方法观察到MSCs定向诱导分化为成骨细胞后，KIAA1077基因的表达上调（资料未显示）. 对KIAA基因和蛋白的研究也是我们以后研究的重点之一.

　　　　【】

　　［1］Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses ［J］. Exp Hematol, 2000,28:875-884.

　　［2］Barry FP, Boynton RE, Haynesworth S, et al. The monoclonal antibody SH22, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin(CD105) ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1999,265(1):134-139.

　　［3］Barry F, Boynton R, Murphy M, et al. The SH23 and SH24 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001,289 (2):519-524.

　　［4］Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［J］. Science, 1999,284(5411):143-147.

　　［5］Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, selfrenewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］. J Cell Biochem, 1997,64:278-294.

　　［6］Kamiya H, Zhangm W, Sima AAF. Apoptotic stress is counterbalanced by survival elements preventing programmed cell death of dorsal root ganglions in subacute Type 1 diabetic BB/Wor rats ［J］. Diabetes, 2005,54:3288-3295.

　　［7］Lee1 JS, Zhang MH,Yun1 EK, et al. Heat shock protein 27 interacts with vimentin and prevents insolubilization of vimentin subunits induced by cadmium［J］. Exp Mol Med, 2005,37(5): 427-435.

　　［8］Koga H, Yuasa S,Nagase T, et al. A comprehensive approach for establishment of the platform to analyze functions of KIAA proteins II: Public release of inaugural version of InGaP Database containing gene/protein expression profiles for 127 Mouse KIAA genes/proteins［J］. DNA Res, 2005,11: 293-304.

　　［9］Nakayama M, Kikuno R, Ohara O. Proteinprotein interactions between large proteins: Twohybrid screening using a functionally classified library composed of long cDNAs ［J］. Genome Res, 2002,12: 1773-1784.