微小颗粒骨复合细胞移植治疗大鼠骨缺损

        作者：麻松，阎景龙，林欣，潘海涛，王新涛，杨显生

【关键词】  颅骨缺损；骨移植；细胞移植；微小颗粒骨

　　Treatment of rat cranial defect with autogenetic minimal morselized bone and allogenic cells

　　【Abstract】 AIM: To investigate the combined  treatment effects of autogenetic minimal morselized bone and allogenic cells on rat cranial defect. METHODS: Cranial defect in rat models was repaired with autogenetic minimal morselized bone graft and allogenic cell  transplantation［osteoblasts or marrow stormal cells (MSC)］. X ray was taken to understand the union condition, and RTPCR was performed to examine the mRNA expressions of TGFβ1 and bFGF. RESULTS: In the order of combined treatment group A (morselized bone and osteoblast graft), combined  treatment group B(morselized bone and MSC graft), combined treatment group C(minimal morselized bone only), the union time of cranial defect prolonged as (7.33±0.44) wk, (8.67±0.69) wk and (11.67±1.52) wk, and the expression of TGFβ1 and bFGF emerged in the order (P<0.05 between every 2 groups). CONCLUSION: The combined therapy of minimal morselized bone and allogenic cells accelerate the repairment of cranial defect and the expression of cell factors.
  
　　【Keywords】 cranial defect; bone transplantation; cell transplantation; minimal morselized bone

　　【摘要】 目的： 观察自体微小颗粒骨复合骨髓基质细胞（MSC）或成骨细胞移植修复大鼠骨缺损的效果. 方法： 制作大鼠颅骨缺损动物模型，培养同种异体新生大鼠的MSC及成骨细胞，复合自体颗粒骨后植入骨缺损区，X线摄片观察骨愈合情况；RTPCR检测转化生长因子β1（TGFβ1），碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平. 结果： 植入微小颗粒骨复合成骨细胞组颅骨缺损愈合最快（7.33±0.44） wk，TGFβ1, bFGF表达出现早，与其他两组比较差异显著（P<0.05）. 植入微小颗粒骨复合MSC组颅骨缺损愈合时间居中（8.67±0.69） wk，TGFβ1, bFGF表达早于单纯微小颗粒骨组（P<0.05）. 单纯微小颗粒骨植入组颅骨缺损愈合慢（11.67±1.52） wk，TGFβ1, bFGF表达出现晚. 结论： 微小颗粒骨复合细胞移植修复颅骨缺损，细胞因子表达早，缺损愈合明显加快.
 
　　【关键词】 颅骨缺损；骨移植；细胞移植；微小颗粒骨

　　0引言

　　骨缺损的修复是骨科的研究热点之一，自体骨移植被认为是修复骨缺损的金标准，方法多采用块状或条状骨移植. 颗粒骨移植近年来正逐渐受到重视，广泛应用于关节翻修手术中［1］. 微小颗粒骨有利于骨折愈合也有报道［2］. 我们通过微小颗粒骨复合细胞移植修复大鼠颅骨缺损，观察骨愈合情况及在此过程中转化生长因子β1（TGFβ1）及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达情况，探讨修复骨缺损的有效方法.

　　1材料和方法

　　1.1材料出生9 d健康SD雄性大鼠144只,体质量200~220 g由哈尔滨医科大学附属第二动物室提供；DMEM培养液购自美国Gibco公司；150 mL/L胎牛血清冲，CO2培养箱，Ⅱ型胶原酶均购自美国Sigma公司.
 
　　1．2方法将大鼠随机分为3组：单纯微小颗粒骨植入组(第1组)，微小颗粒骨复合骨髓基质细胞（marrow stormal cells, MSC)组(第2组)，微小颗粒骨复合成骨细胞组(第3组)，每组48只. SD大鼠处死后750 mL/L乙醇浸泡5 min，双侧股骨髓腔DMEM加150 mL/L胎牛血清冲洗，冲洗液加入培养瓶中置入CO2培养箱中培养MSC. 取颅盖骨剪碎，以Ⅱ型胶原酶（1 g/L）消化法［3］培养成骨细胞. 每3 d换液1次，长满瓶后消化，1∶2传代.
 
　　1.2．1颅骨缺损的修复实验动物取髂嵴切口，取自体髂骨约1000 mg磨钻制成直径300~500 μm的颗粒，分别取培养的MSC及成骨细胞，消化后调整计数5×108/L，取5 mL与颗粒骨混合后37℃水浴震荡90 min备用. 颅骨正中切口，显露大鼠顶骨及额骨，左侧顶骨正中制作5 mm全层骨缺损，注意保持硬膜完整. 颗粒骨及细胞混合液离心，将离心管底复合的颗粒骨及细胞植入骨缺损区，缝合切口. 第1组： 单纯植入颗粒骨；第2组： 植入颗粒骨及MSC；第3组植入颗粒骨及成骨细胞. 植入后3, 5, 7, 9, 15, 21, 36和56 d取材进行TGFβ1及bFGF mRNA检测. 第2, 4, 6, 8, 10, 12, 14和16 wk取颅骨进行X线摄片观察骨缺损愈合情况.
 
　　1．2．2RTPCR TGFβ1及bFGF mRNA检测骨组织研碎后按TRIZOL试剂盒说明进行组织RNA提取. 按［4］提供的序列由上海博亚公司合成引物. TGFβ1序列： 上游引物： TACATTGACTTTAGGAAGGA；下游引物： ATCATGTTGGACAACTGATCC. 扩增产物长度252 bp，βactin扩增产物长度500 bp. bFGF序列： 上游引物： GCGACCCACACGTCAAACTACAGC；下游引物： ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTGCCA. 扩增产物长度231 bp，βactin扩增产物长度500 bp. 按说明书进行反转录及PCR扩增. 产物15 g/L琼脂糖上电泳.

　　2结果

　　颅骨缺损修复X线，第3组较早期既有成骨表现，骨缺损愈合时间为(7.33±0.44) wk，快于其他两组（P<0.05）. 第2组缺损愈合时间为(8.67±0.69) wk,慢于第3组，快于第1组（P<0.05）. 第1组愈合时间为(11.67±1.52) wk. RTPCR电泳结果显示，TGFβ1第3组表达时间早，高峰水平与其他两组接近；第2组表达时间较第1组早，高峰水平接近. bFGF第3组骨钙素基因表达出现早，且表达水平高，高峰持续时间未延长；第2组表达高峰在9~10 d，其高峰水平低于第3组；第1组表达高峰出现晚，表达水平较低(图1，2).

　　图1颗粒骨复合MSC缺损修复时TGFβ1 mRNA的表达  （略）

　　图2颗粒骨复合MSC缺损修复bFGFmRNA的表达（略）

　　3讨论
   
　　自体骨移植是骨缺损的有效方法，近年微小颗粒骨移植有见报告. 我们发现复合成骨细胞后，微小颗粒骨修复骨缺损加快，其TGFβ1基因表达高峰提前，表达水平也升高，同时bFGF表达高峰也提前. 复合基质细胞后成骨效果优于单纯微小颗粒骨移植，这两种基因的表达较单纯植入颗粒骨组提前. 本实验说明自体微小颗粒骨可以和细胞结合，进行复合移植修复骨缺损，移植细胞和颗粒骨可以协同作用，提高成骨效果.
 
　　细胞和载体复合方法很多［3-5］，包括浸渍法、沉淀法、吸附法、凝胶法 、动态培养系统等.  5 mm颅骨缺损动物模型是用于研究骨缺损治疗的标准模型. 通过术后X线观察，我们发现复合成骨细胞后，微小颗粒骨修复骨缺损加快，复合基质细胞后成骨效果也优于单纯微小颗粒骨移植，说明移植后的同种异体细胞不但存活，而且发挥了作用. 本实验中未采用免疫抑制剂，同种异体移植也获得了较好效果.
 
　　TGFβ是人体内分布最广泛的细胞因子之一，在实验动物的骨折和临床中TGFβ1在骨折早期即出现在骨膜上,TFGβ1促进骨折处MSC和成骨细胞的增殖，在骨缺损修复时也起相同作用. 在人类中最丰富的是酸性FGF（FGF1）和碱性FGF（FGF2，即bFGF）［6-7］.  在正常的伤口愈合和骨折愈合中发挥作用. bFGF提高了脱钙骨的异位能骨成力，提高骨移植物及多孔羟基磷石的接合.

　　【】

　　［1］ John TA,Vaccaro AR, Sah AP, et al. Physical and monetary costs associated with autogenous bone graft harvesting ［J］. Am J Orthop, 2003,32(1):18-23.
 
　　［2］ Atroshi I, Ornstein E, Franzen H, et al. Quality of life after hip revision with impaction bone grafting on a par with that 4 years after primary cemented arthroplasty ［J］. Acta Orthop Scand, 2004,75(6):677-683.

　　［3］ Nieto A, Casas J, Rahhal SM, et al. NGF and TGFbeta mRNA expression  during pregnancy in a rat corneal wound healing model ［J］. Clin Exp Optom, 2003,86(4):239-243.

　　［4］ Ge X, Tolosa L, Simpson J, et al. Genetically engineered binding proteins as biosensors for fermentation and cell culture ［J］. Biotechnol Bioeng, 2003,84(6):723-731.

　　［5］ DSouza VM, Buckley DJ, Buckley AR, et al. Extracellular glucose concentration alters functional activity of the intestinal oligopeptide transporter (PepT1) in Caco2 cells ［J］. J Pharm Sci, 2003,92(3):594-603.

　　［6］ Sergei A, Kuznetsov, Mahesh HM, et al. Circulating skeletal stem cells ［J］. Cell Biol, 2001,153(5):1133-1140.

　　［7］ 侯占江，阎景龙，付海亮，等. 微小颗粒骨异位成骨过程中碱性成纤维细胞生长因子的表达［J］. 中华创伤杂志，2003,19(12):734-737.