肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义

            作者：赵强子，祁志芳,魏万礼，李开宗，窦科峰

【关键词】  肝肿瘤；RASSF1A基因；甲基化；血浆

　　Diagnostic value of detection of aberrantly methylated RASSF1A in plasma of patients with hepatocellular carcinoma

　　【Abstract】 AIM: To study the aberrant methylation status of Ras association domain family 1A (RASSF1A) in the plasma of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) by methylationspecific PCR (MSP), and to explore the value of circular tumorrelated DNA in diagnosis of HCC. METHODS: Free DNA was extracted from peripheral blood plasma of 41 HCC patients. After modified with sodium bisulfite and purified, the DNA was amplified using primers specific for methylated and unmethylated sequences of RASSF1A. RESULTS: Aberrant RASSF1A methylation was found in 41.5% (17 of 41) of plasma DNA in HCC patients. No methylated RASSF1A was detected in 10 cases of control plasma samples. Clinical data including age, sex, clinical stages, levels of AFP, hepatitis status, number of tumor, invasion, metastasis and cirrhosis showed no correlation with aberrant methylation of RASSF1A （P＞0.05）. Aberrantly methylated RASSF1A was also detected in 7 of 10 plasma samples of AFP negative cases. CONCLUSION: Detection of aberrant methylation of RASSF1A in blood is feasible to early detect and screen HCC, and is useful to estimate the prognosis.

　　【Keywords】 liver neoplasms; Ras association domain family 1A; methylation; plasma

　　【摘要】 目的：采用甲基化特异性PCR法（MSP）检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况，探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义. 方法：收集患者血浆，提取游离DNA，亚硫酸氢钠修饰并纯化，以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR. 结果： 41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化（41.5％），对照血浆均为阴性. 患者一般情况、临床病理资料等与血浆中RASSF1A异常高甲基化检测结果无关（P＞0.05）；在10例AFP阴性的HCC患者中，有7例结果为阳性. 结论：血浆RASSF1A甲基化检测对肝癌的早期诊断及筛选有重要意义，并有助于判断预后.

　　【关键词】 肝肿瘤；RASSF1A基因；甲基化；血浆

　　0引言

　　发现相对特异性的肿瘤标志物，尤其是能够起到早期筛选作用的标志物，对提高包括HCC在内的肿瘤诊断及效果具有重要意义. 肝癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛异常高甲基化可达100％ 的检测结果［1-2］. 我们在前期研究肝癌组织标本中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的基础上，观察患者血浆中RASSF1A基因启动子区异常甲基化情况，以证实其在肝癌诊断中的作用.

　　1对象和方法

　　1.1对象41例肝癌血浆全部收集自第四军医大学附属西京200310/200503手术治疗的患者，血浆于所有治疗未介入时采集，全部配对标本均经术后组织学证实为原发性肝细胞癌，其中男36例，女5例，全组平均年龄50.2岁. 10例健康对照血浆来自健康献血者.

　　亚硫酸氢钠购自Sigma公司，DNA纯化试剂盒购自Promega公司. 引物由上海华大基因公司合成［3］，序列如表1所示.

　　1.2方法

　　1.2.1分组标准依照EdmondsonSteiner四级分法将标本分为高/中分化组及低分化组；肿瘤分期依照国际抗癌联盟TNM分期标准分为Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期二组，HBV感染判定参照临床标准；血浆AFP检测结果按＜400 ng/mL，≥400 ng/mL分二组；病灶情况、血管累及、转移及肝硬化按照术中记录判断.表1引物序列及PCR反应条件（略）

　　1.2.2DNA提取血浆DNA提取按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)说明书进行，每份样本采用800 μL血浆，提取产物分光光度计定量后-20℃保存.

　　1.2.3甲基化特异性PCR(MSP)检测取5 μg血浆DNA，97℃变性6 min，加入亚硫酸氢钠（3.5 mol/L）及对苯二酚（1 mmol/L）55℃处理16 h，结果参照Wizard DNA cleanup system（Promega）说明纯化，以NaOH（0.3 mol/L）室温处理10 min，冰冷乙醇沉淀，重溶于去离子水，以亚硫酸氢钠处理的基因组DNA为底物，加入上述引物对，反应条件为： 95℃预变性15 min, 继以95℃（50 s）, 60℃（1 min），72℃（1 min）共35个循环,最后于72℃延伸10 min. 扩增产物以30 g/L琼脂糖凝胶电泳，FR200A型紫外凝胶成像仪观察结果并拍照.

　　统计学处理：采用SPSS 10.0软件包进行χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1血浆RASSF1A基因异常甲基化检测采用MSP法对41例患者血浆进行RASSF1A基因呈现异常高甲基化检测，结果17例为阳性，占总体41.5％，对照10份来自健康对照的血浆中无阳性结果（图1），说明相对于正常对照，肝癌患者血浆中异常高甲基化的游离RASSF1A基因与肝癌自身有关. 进一步将配对标本的MSP检测结果（已另文发表）对比后发现：血浆MSP检测结果阳性者全部为标本MSP阳性患者，符合率100％，血浆检测结果与其相应的肿瘤组织二者关系密切，说明血浆RASSF1A异常甲基化能较好的反应其肿瘤来源特异性.

　　2.2统计分析按照表2中临床资料及血浆MSP检测结果，进行统计学处理发现，血浆RASSF1A基因异常甲基化与患者年龄、性别，血清AFP、HBV感染，以及肿瘤恶性程度、分期、病灶的大小、数目、侵犯及转移等均无关（P>0.05），然而在AFP阴性（＜400 ng/mL）的10例患者中，有7例血浆MSP结果为阳性（表3）. 41例血浆标本中，AFP阳性率75.6％（31/41）,敏感性优于RASSF1A，但分组结果发现，在AFP检测阴性的血浆标本中RASSF1A异常甲基化阳性率达70％（7/10）,提示血液循环DNA异常甲基化具有诊断学价值，如联合AFP阳性及RASSF1A异常甲基化阳性结果则可使诊断敏感性上升至92.7％（38/41）.表2肝癌患者血浆游离RASSF1A异常甲基化检测结果分析（略）

　　3讨论

　　研究非侵入性肿瘤检测及筛选方法的肿瘤特异性标志物，是临床肿瘤研究的重点，在此的过程中，有实验注意到起源于肿瘤的核酸能够在患者血液循环中检测到，并因此循环核酸检测有望成为一种早期检查肿瘤的方法［3］. 然而基因突变、杂合性丢失等，在肿瘤演进中存在随机的、个体化的特点，尚难以在其中找到共性的，适用于所有肿瘤或同类肿瘤的标志物，有其局限性的一面；相对而言，异常甲基化在肿瘤中属于普遍现象，并可以在患者血液循环DNA中得到体现. 比较RNA及蛋白类而言，DNA具有更大的稳定性，因而肿瘤DNA异常甲基化现象为探索广泛适用的肿瘤生物学标志提供了契机［4-5］.

　　RASSF1A基因在恶性肿瘤中有频繁的甲基化，被广泛应用于肿瘤表遗传学研究，研究结果显示：肿瘤患者体液中亦存在RASSF1A基因启动子区异常甲基化，并与相应肿瘤组织检测结果明显相关. 如在50％小细胞型肺癌患者痰液中、   80％以上的肾癌患者尿液中、23％的乳腺癌患者血浆中、100％的卵巢癌患者腹水中等，均可检测到RASSF1A基因异常甲基化. 体液检测RASSF1A异常甲基化有希望成为肿瘤筛选的诊断方法［6］.

　　本组实验在41例原发性肝癌患者血浆进行RASSF1A基因启动子区CpG岛异常甲基化检测中发现其阳性率为41.5％， 而且在AFP阴性检测的10例患者中有7例为阳性，通过实验证实HCC患者外周血中肿瘤相关性游离DNA的存在，并证实通过MSP法检测血浆中DNA具有提高HCC检出率的重要作用. 实验分组中各临床病理资料均未显示明确的相关性，则说明HCC患者血浆中RASSF1A测定有早期预示肿瘤的作用，因早期诊断并采取进一步的诊断和，直接影响到肿瘤的预后［7-8］，所以此项检测具有深入研究的价值，另外，由于此项检测的肿瘤特异性，对手术后的患者进行血浆检测可能提示肿瘤术后复发，因而有助于肝癌预后判断.

　　总之，实验初步完成HCC血循环中RASSF1A异常甲基化的检测，而鉴于此现象在肿瘤中的广泛性，其方法及结论同样适用于其他恶性肿瘤，为后续实验打好基础，在肝癌的诊治及预后方面具有重要意义［9］.

　　【】

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