TDI

           作者：樊江波，曲群，吴静，张菊，高艳娥，张格林

【关键词】  人乳头瘤病毒；基因分型；宫颈肿瘤；荧光偏振;,基因突变

　　【Abstract】 AIM： To detect HPV16 E7 nt647 point mutation in cervical cancerous tissue using TDIFP technique in order to provide valuable clinical data for warning, detection, diagnosis, gene therapy, prevention and prognosis of cervical cancer and precancerous lesion with HPV infections. METHODS：TDIFP technique is a compounded reaction including PCR, probe hybridization and base incorporation with high specificity and sensitivity. We detected the point mutation of HPV16 E7 nt647 in the detected HPV 16 positive cervical cancerous tissue by the TDIFP method, which can explain the correlation between the point mutation and cervical cancer. RESULTS： The HPV16 E7 nt647 point mutation rate was 32.35% in the study. The point mutation rate of HPV16 E7 nt647 was significantly different from that of the control group （χ2=12.437，P＜0.001）. CONCLUSION： The point mutation of HPV16 E7 nt647 may be a high risk factor for cervical cancer.

　　【Keywords】 human papillomavirus;   genotyping; cervical neoplasms; fluorescence polarization; gene mutation

　　【摘要】 目的：人乳头瘤病毒（HPV）16型E6E7基因的变异可能和HPV的致癌能力直接相关，E7 647位点的突变可能增强了致癌能力. 本课题通过应用TDIFP法检测宫颈癌HPV16阳性标本中E7 647位点突变情况，可以对确定高危人群、恶性病变的预警筛查、辅助诊断、疗效判定及预后提供临床价值，并可以为宫颈癌及其癌前病变的基因、疫苗治疗和预防提供分子水平方面的重要依据. 方法：TDIFP技术是一种在聚合酶链反应的基础上具备液相探针杂交和碱基掺入三重特异反应的检测新方法，具有极高的特异性和敏感性. 本课题实验在TDIFP方法的基础上检测宫颈癌患者HPV16 E7基因647位点突变情况，以进一步明确这些位点突变与宫颈癌变的相关性. 结果：应用TDIFP法检测宫颈癌组织中HPV16型E7 647位突变率为32.35%，HPV16型E7 647位突变与对照组相比具有统计学差异（χ2=12.437，P＜0.001）. 结论：本实验初步提示宫颈癌患者中HPV16型E7 647位突变可能是HPV致癌的一个高危因素.

　　【关键词】 人乳头瘤病毒；基因分型；宫颈肿瘤；荧光偏振; 基因突变

　　0引言

　　宫颈癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤. 目前研究表明，世界上99%以上的宫颈癌组织中存在HPV感染，并且世界卫生组织于1996年确认HPV感染是宫颈癌的主要病因. HPV16和HPV 18型是宫颈癌中最常见型别，HPV16在至少50%的宫颈癌中能发现. HPV16型存在许多基因变异（突变、插入、颠换等形式）. HPV16型 E6/E7基因的变异和HPV的致癌能力可能直接相关. 有研究表明HPV16 E7基因的第647位碱基存在一定的突变（A→G，Asn→Ser），此突变在亚洲某些国家具有较强的致病性，存在此突变提示患者病情较重或预示着癌变的发生. 目前，国内对此研究较少，故对HPV16 E7 647位点突变的研究对于从基因水平早期预测癌变的发生及疾病的预后有着重要的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　实验组选取通过TDIFP HPV分型检测法［1-2］所得到的宫颈癌HPV16型阳性标本共34例，对照组选取HPV16阳性慢性宫颈炎及癌前病变标本共50例. 标本采集自200402/200508交大二院妇产科宫颈癌、癌前病变及慢性宫颈炎患者之病变组织，标本于-20℃冰箱保存. 所有标本均经病理确诊. 实验组按FIGO分期Ia期宫颈癌患者共9例，Ib-IIa期宫颈癌患者共19例， IIb期以上宫颈癌患者共6例，均经病理确诊为鳞状细胞癌. 实验组与对照组患者年龄无统计学差异（P＞0.05）. 目前研究未发现年龄与HPV16 E7突变有相关性. 主要实验仪器与试剂：TechGene PCR扩增仪（英国Techne公司），Victor2 Multilabel Counter荧光偏振检测仪（美国Perkin Elmer公司）. 核酸凝胶片断回收试剂盒ConcertTM Rapid Gel Extraction System（美国Gibco公司），克隆载体试剂盒:pGEMRT Easy Vector SystemⅠ(美国Promega公司)，质粒提取试剂盒:GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit (美国Sigma公司)，TDIFP（荧光偏振）检测试剂盒：AcycloPrimeTMFP SNP Detection Kit G/T和A/G（美国Perkin Elmer公司）. pGEMT Easy质粒，由第四军医大学基因研究所张菊副教授惠赠. 细菌菌株：DH5α基因型：supE44,ΔlacU169(Φ80lacZΔM15),hsdR17,recA1,endA1, gyrA96, thi1,relA1.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计根据GenBank收录的HPV 16基因的原始序列，利用DNA Star:Primer5.0设计包含HPV 16 E7 647位点的上下游引物，引物序列、位置以及PCR产物长度如表1.表1HPV 16 E7基因引物序列、位置以及PCR产物长度（略）

　　1.2.2HPV16E7基因PCR扩增及扩增产物的纯化扩增总体积为25 μL,内含上下游引物各0.25 μmol/L，模板1 μL， Taq DNA聚合酶1.0 u, dNTPs 150 μmol/L, MgCl2 3.0 mmol/L，10×Buffer 2.5 μL. 具体扩增条件：94℃预变性5 min，然后94℃ 40 s, 53℃ 30 s, 72℃ 40 s，35个循环后72℃延伸7 min. 取10 μL PCR反应产物与1/10体积的缓冲液混合，进行15 g/L的琼脂糖凝胶电泳：1×TAE电泳缓冲液，0.5 mg/mL溴化乙锭，5 V/cm电泳30 min后紫外灯下观察. 参照TDIFP试剂盒说明书进行消化反应，以除去PCR扩增反应中剩余的引物和dNTP.

　　1.2.3TDI掺入反应及FP检测将消化以后的产物按照每管7 μL分装于两个干净微量离心管中，分别加入已配好的掺入反应混合物（Acyclopol 0.05 μL, 10×Buffer 2.0 μL,点突变检测探针0.5 μL，Acyclopol Terminator MIX 1.5 μL,去离子水8.95 μL） 13 μL，总体系20 μL. 掺入反应条件：95℃预变性2 min，然后94℃ 15 s, 54℃ 30 s，30个循环后15℃延伸10 min. 将掺入产物10 μL加入微孔板，置于荧光偏振检测仪Victor2 Multilabel Counter中进行FP检测. 利用荧光偏振分析软件“SNP macro VICTOR 384v 4.0”来分析检测结果.

　　1.2.4统计分析及测序组间突变率比较采用χ2检验，统计经SPSS 11.0软件处理，P＜0.01或P＜0.05时，有统计学意义. 随机挑选HPV16 E7 647位突变与未突变标本各5例，进行测序. 将其电泳分离、回收克隆入pGEMTeasy载体中，每份挑选2个经氨苄青霉素抗性、蓝白筛选，以及PCR扩增鉴定的阳性克隆，由上海博亚生物技术有限公司PE ABI377自动测序仪测序.

　　2结果

　　2.1HPV16 E7基因的扩增以HPV16阳性标本为模板PCR产物10 μL 15 g/L琼脂糖凝胶电泳结果如图1，PCR产物片段长度为168 bp.

　　2.2HPV16型E7 647位突变TDIFP法检测结果应用HPV TDIFP突变检测方法对34例宫颈癌标本及50例对照组标本进行检测. 经检测有13例标本的检测结果位于散点图右下象限，表示ddCTP R110掺入，即A→G突变；71例标本位于左上象限，表示有ddTTPTAMRA掺入，无突变；空白对照结果位于左下象限，表示无终止子掺入. 检测结果见图2及表2.

　　2.3HPV16 E7 647位检测标本的测序验证随机挑选HPV16 E7 647位突变与未突变标本各5例，由上海博亚生物技术有限公司PE ABI377自动测序仪进行测序. 确定HPV16 E7 647位点突变情况，与TDIFP检测结果比较，两者符合率为100%.表2HPV16 E7 647位突变情况（略）

　　3讨论

　　宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，每年有20多万妇女死于宫颈癌［3-4］. 在家，占妇女所有癌症的25%［5］. 大量实验研究表明，世界上99%以上的宫颈癌组织中存在HPV感染，并且世界卫生组织（WHO）已于1996年确认HPV感染是宫颈癌的主要病因［6］. 流行病学研究表明，HPV16和HPV 18型是宫颈癌中最常见型别. 其中HPV16型在至少50%的宫颈癌中能发现. 任何型别的高危型HPV感染均可导致宫颈癌的发生，即使其相关性最低者也高于吸烟与肺癌的相关性，而与慢性乙肝与肝癌的相关性相似［7］.

　　目前世界各国学者通过对HPV致癌机制的研究发现，高危型HPV（16，18型）感染是致癌的主要原因，而导致高危型HPV致癌的主要因素是HPV早晚期基因存在着不同形式的突变，正是由于这些点突变的存在增强了HPV的致癌力［8-12］. 研究发现，HPV16 E6/E7基因的变异和HPV的致癌能力直接相关. 左亚刚等［11］对北京地区人乳头瘤病毒16E7基因变异和序列分析的研究中，发现HPV16全长序列中第647位碱基发生突变（A→G，Asn→Ser），此突变点位于E7区. 韩国学者［13］研究发现，HPV16E7 647位（A→G，Asn→Ser）突变在70%以上的宫颈癌组织中被检测发现，与对照组比较有统计学差异，提示E7癌蛋白的这种变异改变了其生物活性. 目前国内对此位点突变的研究较少，Stephen等［14］对四川地区的宫颈癌组织检测仅得到其突变，未对其进行进一步分析比较和研究. 陈中灿等［15］应用荧光偏振方法检测了33例HPV16阳性宫颈癌标本中HPV16 E7基因第29位密码子（相当于HPV16序列第647位核苷酸）的突变情况，结果发现13例发生了突变（A→G，Asn→Ser），突变率为43.48%. 且突变率随病变程度的升高而增加，提示该突变可能是HPV致癌的一个高危因素. 故由以上可以看出，HPV16型E7 647位突变可能是导致宫颈癌发生的一个重要因素，但其突变情况可能存在地域、人种等差异.

　　本实验对宫颈癌组织HPV16型E7 647位突变情况进行TDIFP法检测，实验组34例宫颈癌组织中11例发生了突变（A→G，Asn→Ser），突变率32.35%；对照组50例中有2例发生了突变（A→G，Asn→Ser），突变率4.0%. 经统计学分析，具有统计学差异（χ2=12.437，P＜0.001）. 提示该突变可能是HPV致癌的一个高危因素，并且该突变可能较为常见. 将实验结果与临床资料进行进一步分析比较， Ia期宫颈癌患者共9例，经检测HPV16型E7 647位的突变率为11.11%（1例突变）；IbIIa期共19例，突变率为36.84%（7例突变）；IIb期以上共6例，突变率为50.00%（3例突变）. 由此可以初步发现，宫颈癌患者中HPV16型E7 647位突变率随病变程度的加重而增加，提示该突变可能是HPV致癌的一个高危因素.

　　TDIFP方法是一种全新的基因变异分析方法，用于基因点突变的检测有突出的优点，首先它的特异性和敏感性高：引物扩增、探针杂交及荧光素标记碱基掺入三重把关保证了其高特异性与敏感性. 其次是检测系统容易建立和优化，检测快速且通量高，一天之内可以完成数千个位点分析［16］. 另外引物不需要特殊修饰，操作简便，所以成本低廉. 因而具有简便、快捷、准确及高通量等特点.

　　目前研究认为，从高危型HPV的最初感染到浸润性宫颈癌的发生大约需要15年左右的时间［17］. 所以，宫颈癌是可以通过早期诊断，继之早期高危型HPV感染来预防的一种特殊癌症. 用定期进行HPV TDIFP法分型检测补充传统的细胞学普查，特别在细胞学正常及不典型性增生的人群中，对预警宫颈细胞癌变倾向，及时发现和预防治疗早期宫颈癌极为重要. 同时通过检测与宫颈癌密切相关的恶变点突变，有利于对HPV感染相关良恶性增生病变高危人群的筛查，并且可以对恶性病变危险度进行进一步预警分析，为进一步的生物、疫苗、基因等治疗奠定了基础并提供了技术平台.

　　【】

　　［1］Gao YE, Zhang J,Wu J,et al. Detection and genotyping of human papillomavirus DNA in cervical cancer tissues with fluorescence polarization［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2003,35(11):1029-1034.

　　［2］Zhang J, Gao YE, Yan XJ,et al. Development of a high throughput gene diagnosis assay for genotyping human papillomavirus［J］. Chin J Lab Med,2003,26(3):145-147.

　　［3］Pisani P,Bray F,Parkin DM.Estimates of the worldwide prevalence of cancer for 25 sites in the adult population［J］.Int J Cancer,2002,97:72-81.

　　［4］Parkin DM,Pisani P,Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990［J］.Int J Cancer,1999,80(6):827-841.

　　［5］Burd EM.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Clin Microbiol Rev,2003,16(1):1-17.

　　［6］Ferenczy A,Franco E.Persistent human papillomavirus infection and cervical neoplasia［J］.Lancet Oncol,2002,3(1):11-16.

　　［7］Ferenczy A,Franco E.Persistent human papillomavirus infection and cervical neoplasia［J］.Lancet Oncol,2002,3(1):11-16.

　　［8］Hu X,Pang T,Guo Z,et al.HPV16 E6 gene variations in invasive cervical squamous cell carcinoma and cancer in situ from Russian patients［J］.Br J Cancer,2001,84(6):791-795.

　　［9］Pang T,Hu X,Mazurenko N,et al.Multiple variants of HPV16 E6 gene in cervial invasive squamous cell carcinoma［J］.Anticancer Res,2002,22(2A):1011-1016.

　　［10］Radhakrishna Pillai M, Sreevidya S, Pollock BH, et al. Human papillomavirus type 16 E6 and E7 gene variations in Indian cervical cancer［J］. Gynecol Oncol,2002,87(3):268-273.

　　［11］左亚刚，王家壁，许雪梅，等. 北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析［J］. 中华皮肤科杂志，2003，36(11):650-652.

　　［12］Vaeteewoottacharn K, Jearanaikoon P, Ponglikitmongkol M. Comutation of human papillomavirus type 16 E6 and E7 genes in Thai squamous cervical carcinomas［J］. Anticancer Res,2003,23(2C):1927-1931.

　　［13］Song YS,Kee SH,Kim JW,et al.Major sequence variants in E7 gene of human papillomavirus type 16 from cervical cancerous and noncancerous lesions of Korean women［J］.Gynecol Oncol,1997,66:275-281.

　　［14］Stephen AL,Thomposm Ch,Tattersall MH,et al.Analysis of mutations in URR and E6/E7 oncogenes of HPV16 cervical cancer isolates from central China［J］.Int J Cancer,2000,86:695-701.

　　［15］陈中灿，张菊，高艳娥，等. 荧光偏振方法快速检测HPV 16 E7第29位密码子点突变［J］. 第四军医大学学报，2004，25(15):1403-1406.

　　［16］Chen X, Levine L, Kwok PY. Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis［J］. Genome Res,1999, 9(5):492-498.

　　［17］Franco EL, Rohan TE, Villa LL. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer［J］. J Natl Cancer Inst,1999,91(6):506-511.