不同成分淋巴细胞输注对荷瘤小鼠异基因骨髓移植的影响

【关键词】  骨髓移植；淋巴细胞输注；移植物抗宿主病；嵌合状态

　　Effect of heterogenous DLI on tumorbearing mouse treated with alloBMT

　　【Abstract】 AIM: To establish a tumorbearing mouse model of allogenic bone marrow transplantation (alloBMT) with nonlethal preconditioning, to observe the antitumor effect of heterogenous donor lymphocyte infusion (DLI) after alloBMT and to research the mechanism. METHODS: Recipient mouse was Balb/c (H2Kd)， and donor was C57bl/6(H2Kb). Hepatoma H22 cells were injected into the abdominal cavity of all recipient mice， and after that the living status was observed. Five days later， the recipients were treated with preconditioning (TBI 3 Gy+CTX 200 mg/kg). The bone marrow cells of the donors were transplanted to the recipients via vena caudalis. Fifty recipient mice were divided evenly into 5 groups (A， B， C， D and E groups) at random， according to different DLI. Group A was injected 0.5×107 whole spleen cells from donor mice on day 1， 7 after transplantation; group B was injected 0.5×107 CD8+Tcelldepleted spleen cells from  donor mice on day 1， 7; group C was injected 0.5×107 CD4+Tcelldepleted spleen cells from donor mice on day 1， 7; group D， as control group， was just preconditioned but not transplanted or DLI; group E， the blank control group， was neither preconditioned neither transplanted nor DLI. After that life span， the chimerism， hematopoiesis recovery and graft versus host disease (GVHD) were observed. RESULTS: All recipients showed ascites. Life span of group E was (20.1±3.4) d， shorter than the others. The group C had a longest life span ［(35.6±3.1) d］. Statistical difference was found between group B and C in life span (P<0.05). The chimerism of group A， B and C was above 80%. The hematopoiesis of group D （control group）， recovered under no interference. The hematopoiesis recovery of group B was slower than the others. The GVHD scores of group B were higher than those of group A and C. Statistical difference was found between group B and C in GVHD scores （P<0.05）. CONCLUSION: The nonlethal precondition (TBI 3 Gy+CTX 200 mg/kg) of mouse model was suitable. When CD4+Tcelldepleted spleen cells were used for DLI， the recipients showed mild GVHD and survived longer due to the slow growth of the tumour cells). But CD8+Tcelldepleted spleen cells acted reversely.

　　【Keywords】 bone marrow transplant; lymphocyte transfusion; graft versus host disease; chimerism

　　【摘要】 目的：建立荷瘤小鼠非清髓异基因骨髓干细胞移植模型，探讨不同成分的供者淋巴细胞输注（DLI）对移植效果的影响及抗肿瘤机制. 方法： 受者鼠为Balb/c(H2Kd)小鼠，供者鼠为C57bl/6(H2Kb)小鼠，受者小鼠腹腔接种小鼠肝癌细胞株H22细胞，观察腹水生成情况及生存状况. 于接种瘤细胞后d5给予全身照射预处理，随后给受者小鼠尾静脉输注供者鼠的骨髓细胞，建立荷瘤小鼠的MHC不相合亚移植模型. 依据不同DLI将荷瘤鼠受者鼠随机分为A,B,C,D,E组，每组10只. A,B,C,D组均给予预处理，A组预处理后于移植d1，7给予供者小鼠全脾细胞0.5×107个；B组分别于移植d1，7给予去除CD8+细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；C组于移植d1，7给予去除CD4+细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；D 组只接受预处理不作移植及DLI；E组为对照组，既不作预处理，也不接受骨髓细胞移植及DLI. 观察各组成瘤率、生存期、嵌合状态、造血恢复情况及移植物抗宿主病（GVHD）. 结果：所有小鼠均产生腹水，成瘤率100％；生存期C组最长为（35.6±3.1）d，B组为（23.7±10.9）d，B，C两组相比有统计学差异(P<0.05)；接受移植的A，B，C组嵌合率均高于0.80，只接受预处理的D组鼠白细胞计数自行恢复正常；GVHD评分C组与B组有明显差异(P<0.05). 结论：建立非清髓荷瘤小鼠异基因骨髓干细胞移植模型条件适宜，说明去除CD4+细胞的DLI能够有效地减轻GVHD反应，延长荷瘤鼠生存期;去除CD8+细胞的DLI会加重GVHD反应，影响移植.

　　【关键词】 骨髓移植；淋巴细胞输注；移植物抗宿主病；嵌合状态

　　0引言

　　造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)最初应用于血液系统恶性肿瘤. 20世纪90年代以来，HSCT技术飞速，愈趋成熟，更为安全有效，不仅成为治愈白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统恶性疾病的有效方法，而且也是一些良性血液病和某些实体肿瘤治疗的重要方法之一［1-2］. 随着对HSCT研究的不断深入，人们对其原理有了更为理性的认识，自体造血干细胞移植虽然可以有效减少GVHD的发生，但是由于移植的细胞中肿瘤细胞很难清除干净，从而导致高复发率，另外肿瘤导致的免疫耐受，降低了移植物抗肿瘤（graft versus toumor，GVT）效果；异体同基因移植虽可以解决上述问题但是适宜的供者难以得到，同种异基因移植便成为一种选择，而异基因移植易继发严重的GVHD，使其应用受到很大限制. 由于认识到植活主要是T细胞的早期功能事件，而GVHD 往往是植活以后发生. 完全去除T细胞的移植虽然可以有效地预防GVHD，但会降低移植的成功率、同时肿瘤的复发率及病毒、真菌的感染率增高. 如何提高移植后GVT效应，同时减少GVHD的发生成为研究的热点，近年来开展的供者淋巴细胞输注疗法主要用于造血干细胞移植后，防止或治疗白血病的复发，是一种过继免疫疗法. 而不同成分的淋巴细胞输注可以改变疗效，减轻GVHD反应. 本研究旨在建立荷瘤小鼠异基因骨髓移植模型，并在移植模型中通过改变DLI成分来观察移植效果、抗肿瘤效果及GVHD的差别.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　受者鼠为Balb/c(H2Kd)小鼠雌性50只，供者鼠C57bl/6(H2Kb)小鼠雄性，均为第四军医大学动物中心提供，6～8周龄清洁级小鼠，质量(20.2±1.5) g，在无菌动物层流实验室按清洁级动物实验要求饲养. 小鼠在骨髓移植前1 wk接受添加红霉素(250 ｍｇ/Ｌ)和庆大霉素(320 ｍｇ/Ｌ)的饮水，并持续到移植后2 wk. 小鼠肝癌细胞株H22细胞由西京肝胆外科冯全新博士所赠. CD8+和CD4+选择分离免疫磁珠试剂盒（Dynal公司）H2KbFITCmAb，CD4FITCmAb，CD8FITCmAb，CD3PEmAb，1640干粉（eBioscience公司）. 流式细胞分析在第四军医大学免疫实验室完成，60Coγ射线照射在第四军医大学动物辐照中心完成. 取C57bl/6小鼠，颈椎脱臼处死后，用750 mL/L乙醇浸泡消毒10 min，在超净台中取出小鼠胫骨和股骨，剪开干骺端，用注射器吸取RPMI 1640培养液冲洗出骨髓腔内骨髓，制成细胞悬液，调整细胞数为1.0×1011/L备用. 剖腹，取出脾脏，将脾脏置于200目金属网上，用匀浆器芯轻轻研磨，以RPMI 1640培养液冲洗，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×1011/L. 取部分脾细胞悬液按CD8+选择免疫磁珠分离试剂盒使用说明的步骤：加抗体至待分离的脾细胞悬液静置20 min，再加入免疫磁珠20℃反应15 min，重悬后在磁场中反应2 min，吸取余液即为去除CD8+细胞的脾细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×1011/L，经流式细胞仪检测（图1），分离前CD8+细胞占0.40 (A1)，分离后占0.02（A2），按照相同的方法制备去除CD4+细胞的供者鼠脾细胞悬液，经流式细胞检测，分离前CD4+细胞占0.35 (B1)，分离后占0.02（B2），分离效果明显(图1)，留作DLI备用.

　　1.2方法

　　给受者小鼠Balb/c (H2Kd)鼠腹腔接种H22细胞1.0×108个细胞，腹水成瘤率100％. 接种瘤细胞后d 5接受预处理，所有受者鼠接受全身照射采用60Coγ射线照射，剂量3 Gy，剂量率60.24 cGy/min，照射d2开始移植，d3给予环磷酰胺200 mg/kg ip. 所有操作均在无菌环境下完成. 建立荷瘤小鼠的MHC不相合亚移植模型，流式细胞分析技术鉴定嵌合状态. 于60Coγ射线照射d2，经尾静脉注射制备好的供者鼠骨髓细胞2.0×107个，依不同DLI将荷瘤受者鼠随机分为A，B，C，D，E组，每组10只. A，B，C，D组均给予预处理，E组为空白对照组，不接受预处理及移植. A组预处理后于移植d1，7给予供者小鼠全脾细胞0.5×107个；B组分别于移植d 1，7给予去除CD8+细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；C组于移植d1， 7给予去除CD4+细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；D组只接受预处理不作移植及DLI. 观察各组生存期、嵌合状态、造血恢复情况及移植物抗宿主反应. 从接种瘤细胞开始生存期. 骨髓移植后2 wk，取各组每只小鼠外周20 μL，肝素抗凝，分别加入1 μL H2KbFITCmAb，置4℃孵育45 min；以TrisNH4Cl溶解红细胞，磷酸盐缓冲液洗2遍后，进行流式细胞仪荧光强度的检测. 同时取3份正常C57bl/6小鼠外周血作为阳性对照标本，3份正常Balb/c小鼠外周血作为阴性对照标本. 比较各组嵌合细胞百分率的差异. 分别于移植的d 1，d 3，d 7，d 11，d 15，d 20时采集尾静脉外周血常规白细胞计数. 移植后GVHD反应：观察有无腹泻、质量下降、弓背、耸毛、活动度差等表现，据此作临床GVHD评分. 质量重下降<10%为0分，10%～25%为1分，>25%为2分. 无活动度下降、姿势异常、耸毛为0分，轻度活动度下降、耸毛、姿势异常判为1分，重度活动度下降、耸毛、姿势呈弓背样改变为2 分. 皮肤完整无脱毛为0分、小片浅溃疡、轻度溃疡为1分，大片溃疡、脱毛为2分［3］.

　　统计学处理： 统计学分析采用SPSS 10.0处理，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验，组间生存期比较采用非参数统计方法. P<0.05为有统计学差异.