Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究
【关键词】 Survivin反义核酸；卵巢肿瘤；凋亡；多西他赛；多药耐药基因
Experimental study on apoptosis of ovarian cancer cells and reversal docetaxel drug resistance induced by Survivin antisense RNA
【Abstract】 AIM: To establish Survivin antisense RNA and explore its effect on the apoptosis of ovarian cancer cells and the sensitivity to docetaxel and its mechanism of reversing docetaxel drug resistance. METHODS: Survivin antisense eukaryotic vector (antipcDNA3svv) was transferred into Skov3 cells by electroporation and positive clone was screened out. Survivin protein was detected by Western blot; effect of apoptosis inducement was observed by flow cytometry; sensitivity to docetaxel was examined by MTT; expression of MDR1 mRNA was detected. RESULTS: Survivin protein of positively cloned cells were reduced obviously as compared with that of nontransfered cells. Terminal apoptotic change was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was 19%; IC50 of experimental group to docetaxel was （13.3±2.25） ng/mL and control group was (53.2±2.45) ng/mL, so the statistical difference was significant (P<0.01). Expression of MDR1 mRNA of Skov3SVVanti group was reduced obviously as compared with that of Skov3 group (P<0.01). CONCLUSION: Survivin antisense RNA can induce ovarian cancer cell apoptosis and increase the sensitivity to docetaxel by reducing the expression of MDR1 mRNA.
【Keywords】 survivin antisense RNA; ovarian neoplasms; apoptosis; docetaxel; MDR1
【摘要】 目的: 构建Survivin反义真核表达载体（antipcDNA3svv），探讨其对卵巢癌的凋亡诱导作用、对多西他赛的化疗增敏作用及逆转耐药的机制. 方法：采用Survivin反义核酸瞬时电转染法转染卵巢癌细胞系Skov3, 筛选出阳性细胞株. 以Western blot检测Survivin蛋白的表达，用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用，采用MTT法检测其对多西他赛的化疗增敏作用，并检测实验组细胞（Skov3SVVanti）MDR1 mRNA的表达. 结果：稳定表达antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其Survivin蛋白表达比未转染者明显降低，Skov3SVVanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%，对多西他赛的IC50值为（13.3±2.25）ng/mL,而对照组（Skov3）为(53.2±2.45) ng/mL，差异具有明显的统计学意义(P<0.01). Skov3SVVanti组MDR1 mRNA表达较Skov3组明显减少（P<0.01）. 结论：Survivin反义核酸可诱导卵巢癌细胞凋亡，并通过降低MDR1 mRNA表达增强多西他赛化疗敏感性.
【关键词】 Survivin反义核酸；卵巢肿瘤；凋亡；多西他赛；多药耐药基因
0引言
上皮性卵巢癌是常见的妇科肿瘤，具有易转移及复发的特性，因此手术后化疗是卵巢癌规范化最重要的内容之一. 多西他赛（docetaxel）又名泰索帝是治疗卵巢癌的新药，其联合铂类治疗卵巢癌临床缓解率远高于铂类联合其他化疗药. 但是对于一些复发和多处转移的患者，多西他赛也产生了耐药现象. Survivin是新近发现的IAP(inhibitor of apoptosis protein)家族成员，能抑制caspase 活性而发挥抗凋亡作用. 已有研究证实［1］，Survivin基因的高表达与化疗耐药有密切关系，抑制Survivin基因的表达能增加肿瘤组织对化疗的敏感性，对于维持正常细胞生物学特性具有重要作用［2］. 本研究旨在研究应用反义策略阻断Survivin表达，对诱导卵巢癌细胞凋亡及提高卵巢癌细胞多西他赛敏感性的作用，并进一步探讨其逆转耐药的机制.
1材料和方法
1.1细胞株和细胞培养人卵巢癌细胞株Skov3由哈尔滨医科大学肿瘤研究所惠赠. 用含有100 mL/L胎牛血清（Gibco公司）的RPMI 1640（Gibco公司）培养（37℃，50 mL/L CO2）. 顺铂（F.H.Faulding & Co Ltd公司）及多西他赛（Aventis Pharma, Dagenham公司）溶解于DMSO(Gibco公司)，4℃保存.
1.2Survivin反义真核表达载体（antipcDNA3svv）的构建Survivin基因通过RTPCR方法克隆获得. 应用Trizol（Takara公司）法从卵巢癌细胞株Skov3中抽提总RNA，正向引物为5′atattctagaccatgggtgccccgacgttgc3′,反向引物5′aatcgaattctcaat ccatggcagccagctg3′. PCR扩增条件为：94℃预变性2 min,94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共30循环,72℃延伸10 min，扩增产物用琼脂糖回收试剂盒回收提纯后，扩增产物进行末端连接腺嘌呤（A）反应，与带有胸腺嘧啶末端（T）的载体pcDNA3.1(Invitrogen公司,DNA3.1/CTGFPTOPO)连接. 重组体转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选Amp阳性克隆者小量抽提质粒（质粒抽提试剂盒Takara公司），送去测序（上海生工公司）. 经测序，选出其中反向连接者，命名为antipcDNA3svv.
1.3电转染Skov3细胞及阳性克隆的筛选收集6×106细胞于预冷的0.2 cm电转杯中，加入antipcDNA3svv 15 μL，终体积800 μL， 300 V电压电穿孔14.4 ms，48 h后传代培养，加入含有G418的培养基筛选阳性克隆，浓度由200 mg/L渐加至800 mg/L，共筛选42 d，可见有抗性细胞生长，命名为Skov3SVVanti. 上述同样条件空质粒pcDNA3.1转染Skov3,筛选出阳性克隆命名为Skov3neo. 分为3组：Skov3SVVanti组（实验组）、Skov3neo组（空质粒组）及Skov3组（空白对照组）.
1.4转染细胞Survivin蛋白表达的检测将3组细胞培养48 h，PBS漂洗3次后加入4℃的50 μL裂解液，冰浴20 min，12 000 g/min离心后取上清液. Bradford法测定蛋白浓度. 取每种样品各40 μg，100 g/L SDS PAGE凝胶电泳分离，通过点转移法将蛋白质从SDS PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜后在含有50 g/L脱脂奶粉的TTBS中37℃封闭90 min，加入1∶1000羊抗人Survivin（上海中山公司），4℃过夜，TTBS充分漂洗后加入1∶4000兔抗羊lgG/HRP（上海中山公司）,室温孵育1 h，TTBS充分漂洗，洗膜后加入LumiGLO化学发光试剂作用1 min. X线暗室曝光，常规显影定影. 同样实验条件重复4次. 图像以Bio Rad图像分析系统分析，用蛋白条带的平均光强度值表示Survivin表达的相对强度.
1.5流式细胞仪观察肿瘤细胞凋亡细胞传代培养48 h后，收集10×106个细胞，分成10个样本，每个样本1×106个细胞. 用700 mL/L的乙醇0℃固定，过夜，PBS洗涤并重悬细胞，加入PI染液1 mL（EB 10 μg,PI 50 μg, RNaseⅠ酶10 μg, 枸橼酸钠5 mg, TritonX100为0.4 μL，加生理盐水至1 mL）,室温下孵育30 min,流式细胞仪检测. 观察亚二倍体峰的变化. 凋亡率采用上述样本的均值. 结果以lysisⅡ软件分析.
1.6Skov3SVVanti细胞对多西他赛敏感性分析（MTT）备96孔板，每孔加入100 μL的1×105的Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti细胞，每种细胞加7孔，其中1孔做调零用，每孔依次加入0，1，10，20，50，100 (μg/L)多西他赛， 37℃培养48 h后，每孔加入MTT（10 g/L） 10 μL,培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚枫（DMSO），振荡10 min，酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值. 根据A值细胞存活率并计算细胞生长抑制50%的多西他赛浓度，即IC50值. 记录加多西他赛50 μg/L后0，24，48，72 h细胞生长曲线. 上述实验重复三次，取均值. 三组间IC50比较采用采用方差分析进行.
1.7反义Survivin核酸对MDR1 mRNA表达的影响上述3组细胞利用Trizol(Takara公司)法提取总RNA，RTPCR法扩增MDR1 mRNA，进行比较. MDR1的上、下游引物分别为为：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，扩增片段412 bp. 以βactin为内参照（上、下游引物分别为：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′,扩增片段127 bp）. 扩增产物用20 g/L琼脂糖电泳，根据条带亮度的不同进行分析. MDR指数：MDR值/βactin值. 三组间MDR指数比较采用方差分析.
2结果
2.1重组质粒的构建和鉴定利用RTPCR方法从Skov3细胞克隆出Survivin基因，全长451 bp，经电泳证实扩增片段与预先设计片段大小一致. 与载体pcDNA3.1以AT策略连接后转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆酶切鉴定，再经上海生工公司测序与基因库中序列完全符合（图1），选取其中与pcDNA3.1反向连接者命名为antipcDNA3svv. 由此得到真核表达载体.
2.2转染后稳定表达反义Survivin细胞克隆的获取阴性转染细胞在G418 800 mg/L浓度时死亡，阳性转染细胞渐形成单细胞克隆Skov3SVVanti（图2）. 采用胰酶定点消化的方法，将单细胞克隆洗脱到25 mL细胞培养瓶，进行传代培养，培养成含有antipcDNA3svv的细胞株.
2.3转染antipcDNA3svv对Skov3中Survivin蛋白表达的影响Western blot印迹法显示Skov3SVVanti组Survivin蛋白表达较Skov3neo组和Skov3组明显降低，应用机对条带净密度进行分析Skov3SVVanti组Survivin蛋白的表达仅为Skov3neo组的29.1%，为Skov3组23.7%.
2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率转染antipcDNA3svv组Skov3细胞亚二倍体峰较转染空质粒组和未转染组都明显为高，10个样本平均凋亡率达到19%，而转染空质粒组及未转染组均为2%（图3）.
2.5antipcDNA3svv增加Skov3对多西他赛敏感性的检测各组细胞随着多西他赛药物浓度的提高，细胞存活率都呈下降趋势，但antipcDNA3svv组下降更加明显(表1)，其IC50值为（13.3±2.25） μg/L,而Skov3neo组和Skov3组分别为(48.7±1.12) μg/L和(53.2±2.45) μg/L,与Skov3neo组和Skov3组相比，Skov3SVVanti组的IC50值明显下降，差异具有显著性（P<0.01）. 在多西他赛药物浓度为50 μg/L，Skov3SVVanti组细胞存活率也较其他两组明显下降（图4）.表1不同药物浓度细胞生存率(略)
2.6各组细胞MDR1 mRNA的表达分别从Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti细胞中提取MDR1 mRNA,发现转染antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其MDR1 mRNA表达较其他两组明显降低，而不影响βactin的表达，转染空质粒组比对照组MDR1 mRNA表达亦有下降. 各组MDR指数分别为：0.196±0.013(Skov3SVVanti组),3.126±0.019（Skov3组）,2.958±0.024（Skov3neo组）. 经方差分析， Skov3SVVanti与Skov3neo，Skov3细胞的MDR1 mRNA表达量之间存在差异性（P<0.01）.
3讨论
Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族的新成员，其表达产物具有独特的结构，能够保护特定的细胞抵抗一系列刺激原诱导，具有凋亡抑制、血管保护、调节细胞周期等多种生物学活性. Survivin特异性的表达于胚胎和发育的胎儿组织中，在成人终末分化组织无表达，而在各种肿瘤组织如肺小细胞肺癌、胃癌中则有广泛表达［3-4］. Survivin独特的组织分布使得抑制Survivin蛋白的表达不会对机体产生较大的影响，使其成为肿瘤反义理想的靶基因.
细胞凋亡通路的异常在恶性肿瘤中很常见，凋亡异常使得细胞逃脱正常的监控机制，从而发生细胞分裂的异常以及对放疗、化疗的耐受. 生存素的高表达可能使得卵巢癌细胞更容易逃避G0/G1期和G2/M期的分子检查机制而不发生细胞凋亡. 本研究中成功构建了反义真核表达载体antipcDNA3svv，转染入Skov3细胞，并且筛选出稳定表达antipcDNA3svv的细胞株. 通过Western blot证实稳定表达antipcDNA3svv的实验组其生存蛋白表达明显下降. 在流式细胞仪的检测中实验组可见到一个明显的亚二倍体峰（凋亡峰），而在转染空质粒组则没有，实验组的细胞凋亡率是空质粒组的8.5倍，说明转染antipcDNA3svv的细胞株其凋亡率明显升高. 上述结果表明本实验所构建的antipcDNA3svv转染Skov3细胞后对Survivin蛋白的阻断及对肿瘤细胞的凋亡诱导作用是确切的.
在实性肿瘤中，生存素的过度表达与肿瘤对化疗药物的耐药性有关［5］. 化疗耐药性的产生是影响疗效的关键因素，肿瘤细胞凋亡机制的缺陷是耐药性产生的关键因素之一，对细胞凋亡机制的修复可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，克服耐药性的产生. 多西他赛又名泰索帝，是新发现的多西紫杉醇，药物作用机制与紫杉醇一致，在GTP不足的情况下，诱导β微管蛋白的广泛聚合，使微管积集成束，非常稳定，从而发挥其杀肿瘤作用. 本研究中发现实验组生存素蛋白表达明显下降，对多西他赛的敏感性明显上升，其IC50值为约13 μg/L，而空质粒组和空白对照组分别约为48 μg/L和52 μg/L，具有明显的统计学意义. 在多西他赛药物浓度为50 μg/L，从药物作用6 h起，实验组就与对照组显示出明显的生存差异，实验组细胞生存率明显下降. Muenchen等［6］研究证实Survivin的表达阻断了PC3细胞中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶Caspase3和Caspase7的活性，同时保护肿瘤细胞不受抗肿瘤药物如多西他赛的影响. 有研究显示稳定转染野生型Survivin的卵巢癌细胞对多西他赛的抗药性是对照组的6倍［7］. 本研究中稳定转染反义Survivin的卵巢癌细胞对多西他赛的敏感性是转染空质粒组3.7倍，是未转染组的4倍，实验结果表明抑制生存素的表达对增加卵巢癌对多西他赛的敏感性起着至关重要的作用.
实验结果并提示实验组对多西他赛化疗敏感性的增加有可能与MDR基因表达的下降有关.
综上所述，我们在体外实验中证实了抑制生存素可以诱导卵巢癌细胞的凋亡，并且增加卵巢癌细胞对多西他赛的敏感性，通过抑制生存素的表达及联合化疗药物的应用可能会使卵巢癌在不久的将来得到更为有效的治疗，为反义生存素的临床应用提供新的思路.
【】
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