HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究

【关键词】  肺炎链球菌；毒力因子；密度感应系统；HtrA基因

　　comEffect of HtrA gene deletion on virulence of Streptococcus pneumoniae

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of HtrA gene deletion on the virulence of Streptococcus pneumoniae. METHODS: HtrAdeficient strain was constructed by insertion, replication and inactivation, and identified by PCR. Relative quantitative RTPCR was used to measure the expression levels of virulent factors and study the virulence change by mice virulence experiments. RESULTS: The expression of virulent factors in HtrAdeficient strain was lower than that of the widetype (P＜0.05). Transformation capability of HtrAdeficient strain obviously decreased. Mice virulence experiments showed the median lethal time of the widetype was 22 h, while that of HtrA mutant was 8 d (P＜0.01). The elimination of HtrA mutant in mice blood was faster than that of the widetype. CONCLUSION: The deficiency of HtrA gene decreases the expression of virulent genes and the transformation capability, which finally reduced the bacterial virulence.

　　【Keywords】 Streptococcus pneumoniae; virulence factor; quorum sensing; HtrA gene

　　【摘要】 目的：HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶，本文目的是探索HtrA基因缺陷对细菌毒力的影响. 方法：用插入复制失活的方式使HtrA基因缺失，通过RTPCR分析毒力因子表达，并通过动物试验观察HtrA基因缺陷株毒力改变情况. 结果：RTPCR显示HtrA缺陷株毒力因子表达低于野毒株，两组比较P<0.05；转化试验发现缺陷菌株转化力下降；小鼠毒力试验表明野毒株半数致死时间22 h，而缺陷株半数致死时间8 d，P<0.01，有显著性差异；缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野毒株. 结论：HtrA基因缺陷使肺炎链球菌多种毒力因子表达减弱，转化能力下降，毒力降低.

　　【关键词】 肺炎链球菌；毒力因子；密度感应系统；HtrA基因

　　0引言

　　肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是世界范围内引起感染和死亡的重要病原菌之一，是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎最常见的病原菌［1］. 目前广泛使用的23价肺炎链球菌多糖疫苗免疫原性弱，对老人、幼儿和免疫缺陷疾病患者预防保护效果较差［2］. 以破伤风和白喉类毒素作载体的11价S.pn结合疫苗仅对2岁以下的婴幼儿有较好的免疫原性［3］. 最新研制的S.pn溶血素等蛋白类疫苗也只是处于早期临床试验阶段［4-5］. 要彻底解决S.pn感染的防治关键在于进一步阐明肺炎链球菌致病的分子机制.

　　HtrA (high temperature requirement A)是S.pn的一种热休克诱导的丝氨酸蛋白酶，又叫做DegP或DO蛋白酶［6］. HtrA同时具有一般的分子伴侣功能和蛋白水解活性，环境温度升高时其蛋白酶活性变得明显［7］. 目前，已经在多种生物中发现了HtrA的相似体，比如细菌、酵母、植物［8］和人类［9］. 在这些生物中HtrA的作用大多表现为帮助它们逃避高氧浓度、高温和高渗等环境变化. HtrA存在于多种革兰氏阴性和阳性细菌中，1998年Gasc等［10］于S.pn中首次发现HtrA，并被CiaRH双成分系统(two component systems，TCS)调控［11］. HtrA在一次使用信号标签诱变技术（signaturetagged mutagenesis）的筛选中被认为是S.pn的毒力因子［12］. 2002年Sebert等［13］通过S.pn的幼鼠感染模型进行转录谱基因芯片筛选发现，HtrA可能参与S.pn于鼻咽部的定植. 但HtrA做为S.pn的毒力因子的具体机制目前尚不清楚.

　　为深入探讨HtrA作用机制，我们拟构建HtrA基因的缺陷株，研究缺陷株S.pn毒力的变化，并从S.pn毒力基因的表达、于小鼠体内存活情况和转化能力改变3方面来分析HtrA在S.pn毒力中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　S.pn血清TIGR 4型购自美国标准菌库（ATCC），细菌经鉴定合格：Optochin试验阴性，胆汁溶菌试验阳性，血培养呈光滑、半透明、扁平小菌落伴草绿色α溶血环. S.pn培养用C+Y半合成培养基，含5 g/L酵母抽提物［14］. 质粒筛选用氯霉素LB平板及氯霉素LB液体培养基. 血培养用TSA血平板（含50 mL/L脱纤维全血）. 含氯霉素TSA血平板筛选整合有质粒染色体的缺陷菌. 转化试验用含红霉素TSA血平板. S.pn CPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受态刺激肽（competencestimulating peptide, CSP）和质粒pEVP3由美国Morrison DA教授惠赠. 逆转录酶MMVL及其试剂购自Promega公司. 胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，PCR试剂购自上海生物工程技术服务有限公司，琼脂糖购自BBI公司，DNA分子量标准（SM 0261）购自MBI公司，RNA提取试剂盒为RNeasy Mini Kits，购自德国Qiagen公司，随机引物由上海博亚生物技术有限公司合成，其他引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1.表1各基因引物序列（略）

　　1.2方法

　　1.2.1HtrA缺陷菌株的构建重组质粒的构建：以TIGR 4的DNA为模板，PCR扩增HtrA. 循环条件：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30次循环；20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，并胶回收. 分别用限制性内切酶Bgl II和Sph I将HtrA和pEVP3进行双酶切，胶回收，DNA定量分子量标准定量后将二者连接. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α后铺于氯霉素LB平板（250 mg/L），挑选阳性菌落，在含氯霉素的LB液体培养基（25 mg/L）中增菌，37℃振荡培养3~6 h后提取重组质粒. 用Hind III酶切并用pEVP3测序引物进行PCR扩增，鉴定重组质粒是否构建成功. 构建缺陷菌株：将TIGR 4在CTM培养基（10 mL C+Y中含1 mmol/L CaCl2和2 g/L BSA）中增菌至A620 nm=0.08左右，取100 μL菌液加入5 μL重组质粒和1 μL CSP，37℃水浴90 min，铺于含氯霉素（2.5 mg/L）的TSB平板，37℃孵箱培养24~48 h，挑取血平板上的菌落（缺陷菌株），于含氯霉素（2.5 mg/L）的C+Y培养基中增菌，提取并保存DNA.

　　1.2.2HtrA缺陷菌株的鉴定PCR鉴定：分别以TIGR 4野毒株及其HtrA缺陷菌株（△HtrA）DNA为模板，以HtrA上游引物和pEVP3测序下游引物进行PCR扩增.

　　转化力比较：将TIGR 4，△HtrA在CTM培养基中增菌至A620 nm=0.08左右，取100 μL菌液加入1 μL CSP，10 min后加入2 μL CPM8，37℃水浴90 min，系列稀释后铺于含红霉素（0.25 mg/L）的TSB平板，37℃孵箱培养24~48 h后进行菌落计数，比较二者转化力差别. 最终结果以3次试验的结果的均值来进行比较.

　　1.2.3半定量RT

　　PCR测定毒力因子表达将TIGR 4及△HtrA在C+Y培养基中增菌至相同菌密度，按Qiagen Mini Kits说明书操作提取总RNA.

　　半定量RTPCR：取RNA 11 μL，随机引物1 μL，混匀后70℃变性5 min，立即置冰上. 顺序加入：逆转录缓冲液5 μL，dNTP mix (10 mmol/L) 1.5 μL，RNasin (30 U/μL) 0.5 μL，DEPC水5 μL，逆转录酶MMLV（100 U/μL） 1 μL，混匀，37℃ 1 h，得到cDNA（最后95℃ 5 min，灭活MMLV）. 以cDNA为模板，分别扩增16s rRNA和链球菌表面蛋白A (pneumococcal surface protein A, pspA)、神经酰胺酶(neuraminidase，nanA)和自溶素（major autolysin A, lytA）3个毒力基因，引物序列见表1. 循环参数为：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，30次循环；20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 整个试验重复3次，并进行统计分析.

　　1.2.4小鼠毒力实验将TIGR 4及△HtrA在C+Y培养基中培养到其A620 nm=0.498（菌密度约4×108 cfu/mL）. 将28只Balb/c小鼠随机分为两组，每组14只，分别腹腔注射100 μL TIGR 4菌液和100 μL △HtrA菌液, 均含4×107 cfu. 记录小鼠死亡时间，半数致死时间.

　　1.2.5S.pn体内清除时间测定将TIGR 4及△HtrA于C+Y培养基中培养到A620 nm>0.5，用无菌PBS稀释到菌密度为5×107 cfu/mL. 将48只Balb/c小鼠随机分为两组，分别注射100 μL野生株TIGR 4和100 μL缺陷株△HtrA菌液. 于注射菌液后12，24，36，48 h取小鼠心脏血（每时间段6只），系列稀释后将野毒株株血标本接种于TSA血平板，缺陷菌株血标本接种于含氯霉素（2.5 mg/L）TSA血平板. 37℃，50 mL/L CO2孵箱培养24~48 h，计数菌落，观察细菌在体内被清除情况. 最终的结果以6只老鼠血液中细菌计数的平均值表示.

　　统计学处理：数据以x±s表示，方差齐同时采用t检验，方差不齐时采用t′检验，P<0.05为有统计意义，小鼠毒力实验结果采用Longrank检验，以SAS统计软件进行分析.

　　2结果

　　2.1肺炎链球菌HtrA缺陷菌株的获得利用插入复制失活的方式构建HtrA缺陷菌株△HtrA. PCR扩增出HtrA基因405 bp，然后用Bgl II和Sph I分别将HtrA和pEVP3进行双酶切，胶回收目的片段(图1). 连接后转于DH5α获得重组质粒pEVP3HtrA.

　　用Hind III酶切pEVP3HtrA后可见大（约6250 bp）,小（约450 bp）两个片段(图2A). 以pEVP3多克隆位点两侧测序引物PCR鉴定，表明pEVP3HtrA在660 bp处有目的片段，而pEVP3因没有重组HtrA基因片段，扩增出片断长度仅250 bp(图2B).

　　将pEVP3HtrA转化S.pn TIGR 4，从而得到HtrA基因缺陷菌株△HtrA. 用HtrA上游引物与pEVP3多克隆位点下游测序引物进行PCR鉴定，pEVP3HtrA和△HtrA由于有HtrA基因片段的插入，在660 bp左右均可见目的片段，而TIGR 4和pEVP3则没有该片段的产物(图3).

　　转化试验发现：HtrA缺陷后，其转化能力与其野毒株TIGR 4相比明显下降，甚至完全消失(表2).表2S.pn TIGR 4和△HtrA转化力比较（略）