pH敏感的GMA修饰葡聚糖水凝胶的制备与体外释药研究

          作者：吴红，张镇西，吴道澄，任波，苏丹

【关键词】  药物释放

    Preparation and in vitro evaluation of pH sensitive GMAdextran hydrogels

　　【Abstract】 AIM: To prepare the biodegradable pHsensitive hydrogels for controlled drug delivery and to study its intelligent drugrelease characteristics. METHODS:  Hydrogels were obtained by radical copolymerization of aqueous solution of glycidyl methacrylate derivatived dextran (GMAdex) with acrylic acid (AAc) using ammonium peroxydisulfate (APS) and N,N,N,Ntetramethylethylenediamine (TEMED) as an initiation system. The degree of GMA substitution (DS) was determined by 1HNMR. The hydrogels were subjected to equilibrium swelling studies in enzymefree simulated gastric and intestinal fluids (SGF and SIF). The release profiles of Pingyangmycin (PYM)entrapped hydrogels in vitro were established in enzymefree SGF and SIF. RESULTS:  The DS of GMA was 10.5 and the swelling studies clearly indicated that these hydrogels were more swollen in SIF than those in SGF. The release of PYM from the hydrogels was much faster in SIF. After 24 h, about 22% and 43% of the entrapped drug were released in SGF and SIF, respectively. CONCLUSION:  The swelling and drug release of Poly (GMAdex/AAc) hydrogels are strongly dependent on the pH value.

　　【Keywords】 dextran; acrylic acid; hydrogels; pHsensitive; swelling; drug release

　　【摘要】 目的:研究用于控释体系中的可生物降解的pH敏感水凝胶的制备方法及其智能释药特性. 方法：过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺(TEMED)作引发体系，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)修饰的葡聚糖(GMAdex)与丙烯酸(AAc)自由基共聚制备水凝胶. GMAdex中GMA的取代度（DS）用核磁共振测定. 在无酶的人工胃液与人工肠液中测定凝胶的平衡溶涨率，并分别测定载有平阳霉素的水凝胶在两种释放介质中的释药曲线. 结果：GMA的取代度是10.5，凝胶在人工肠液中的溶涨率明显大于人工胃液，释放平阳霉素的速率也明显快于胃液. 24 h后，人工胃液与肠液中的累积药物释放率分别为22%和43%. 结论：聚(GMAdex/AAc)水凝胶的溶涨与释药具有pH敏感性.

　　【关键词】 葡聚糖；丙烯酸；水凝胶；pH敏感；溶涨；药物释放

　　0引言

　　水凝胶具有良好的物理化学性质和生物相容性，与疏水聚合物相比，水凝胶与被固定在其中的药物或生物活性分子的相互作用极其微小，可使被固定的物质长时间的保持活性. 因此水凝胶在药物控制释放等领域有着广泛的应用. 特别是环境敏感水凝胶作为智能聚合物为设计和制备自调式给药系统和生物工程方面的多种新应用提供了可行性［1］. 它们的特点是随着温度、pH值、离子强度及超声波等外界标志的微小变化，多孔凝胶的相体积会发生较大变化，内含物的释放速度急剧变化，而一旦标志物恢复，相体积与内含物释放速度也恢复原状，此即智能化可逆性响应. 甲基丙烯酸缩水甘油酯（glycidyl methacrylate, GMA）修饰葡聚糖(dextran, dex)水凝胶具有生物可降解性［2］，通过凝胶控制药物或蛋白的释放，但不具备智能化响应特性［3］. 聚丙烯酸水凝胶具有良好的pH响应性，但机械强度较差，限制了其在药物载体方面的应用. 我们将GMA修饰dex(GMAdex)与丙烯酸(AAc)共聚，得到了既有pH响应性、又有一定生物降解性及机械强度的新型水凝胶，并以平阳霉素做药物模型，研究了其酸敏释药特性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　dexT40，北京夏斯生物科技公司进口分装；GMA，百灵威科技有限公司；4（N, N二甲氨基）吡啶（DMAP），湖南海利高新化工有限公司进口分装；四甲基乙二胺（TEMED），上海生工进口分装；平阳霉素（PYM），药品生物制品检定所；过硫酸铵（APS），丙烯酸(AAc)，二甲基亚砜（DMSO），分析纯，西安化学试剂厂；AAc经减压蒸馏除去阻聚剂；无酶人工胃液（SGF，pH 1.2）与人工肠液(SIF，pH 7.2)自制，SGF缓冲液(在1 L蒸馏水中溶解2 g NaCl和7 mL浓HCl)；SIF缓冲液(118 mL 0.2 mol/L的NaOH和250 mL 0.2 mol/L KH2PO4混合后用蒸馏水定容为1 L)；5 mL一次性无菌注射器,威海市医用高分子有限公司；BECKMANDU600紫外分光光度计；体外释药装置自制.

　　1.2方法

　　1.2.1GMAdex的制备参照［4］方法并加以改进.  10 g dex T40溶解在90 mL DMSO中，通氮气，将DMAP 2 g和GMA 1.46 g依次加入，完全溶解后，30℃下搅拌反应30 h (Fig 1), 反应液滴加至400 mL无水乙醇中，静置后抽滤得白色沉淀. 沉淀溶解在4℃ 20 mL双蒸水中，浓盐酸调节pH 7~8，于去离子水中彻底透析（4℃，4 d），冷冻干燥，得白色绒毛状产物即为GMAdex，1HNMR测定取代度(DS，每100个脱水葡糖苷单元含有甲基丙烯酸基团的数目).

　　1.2.2GMAdex/AAc水凝胶的制备称取一定量GMAdex（GMAdex与AAc的质量比为1∶2）溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中；再将一定量AAc溶于适量100 g/L NaOH溶液中，调至中性，氮气保护下，将两者混合；加入微量APS与TEMED，搅拌均匀后迅速吸入注射器中，密封，37℃下反应48 h. 将制备好的水凝胶从注射器中缓缓推出，切成2~3 mm厚的圆片，置于双蒸水中浸泡48 h，除去残余引发剂和单体等杂质，真空干燥后备用.

　　1.2.3溶胀与溶胀率的测定干凝胶（Wd）37℃分别放入pH 1.2及pH 7.2~7.6人工胃液与肠液中，在预定的时间间隔取出，用滤纸吸干表面水分，称质量，直至溶胀平衡，凝胶质量不再增加（Ws），根据公式SR=(Ws-Wd)/Wd出溶胀率.

　　1.2.4药物释放实验10 mg GMAdex/AAc干凝胶放在10 mL (5 g/L)平阳霉素饱和溶液中浸泡48 h，室温干燥后，根据质量差计算载药率. 将含药物的干凝胶块分别放入(37.0±0.5)℃人工胃液、人工肠液中，在设定的时间点定时取样2 mL，立即补加等量同质人工胃液与肠液，在设定的时间点用紫外分光光度法测定累积药物释放量.

　　2结果

　　1HNMR测得GMAdex的取代度DS10.5，符合文献报道的GMAdex水凝胶的降解条件(DS<13)［5］. 溶胀实验表明GMAdex/AAc水凝胶在酸性条件下的溶胀率远远小于在碱性条件下的溶胀率，具有明显的酸敏特性（Fig　2），凝胶在人工胃液与肠液中溶胀20 h后达到溶胀平衡，溶胀率分别为8.3，38.9. 凝胶含水率80.2%，载药率6.2%，载药凝胶在人工胃液中的释药速率明显低于人工肠液（Fig 3），吸收药物凝胶在人工肠液中12 h药物累积释放率约为43%，而在人工胃液中仅释放22%.

　　3讨论

　　本研究中把具有酸敏特性的AAc接枝到具有一定强度的dex载体上，以制备pH响应型、可降解水凝胶. 在载体表面产生自由基是最为有效的制备接枝水凝胶的技术，单体可以通过共价键连接到载体上. 因此本实验中，首先在dex结构中引入反应活性很高的双键，反应单体GMA含量越高，DS越大，凝胶机械强度也越大，溶胀率随之越低，因此应选择合适的DS，以满足水凝胶既有良好的溶胀性能，又有一定力学强度的需要. 因DS13以上的GMAdex难以降解，因此制备了DS10.5的GMAdex，凝胶含水率在78%~82%之间.

　　3.1凝胶制备制备酸敏葡聚糖凝胶时，我们发现GMAdex的DS,原料配比、反应促进剂TEMED的用量及反应介质的pH值等对凝胶的形成均有影响. 当单体总浓度大于15%时，凝胶易形成非均匀区，甚至出现乳白色非透明体. 当单体总浓度小于5%时，凝胶质地太软不便实验操作. 随着AAc含量的增大，凝胶产率下降，可能是因为AAc达到一定浓度与TEMED生成盐，减弱了TEMED的引发效率. GMAdex的取代度越高，越有利于凝胶的形成，但易形成非透明体. 反应促进剂的加入，使得反应在几分钟内既能形成凝胶，TEMED用量越多，反应越快，凝胶产率也越高. 但用量过多，易产生气泡或形成非均匀区，影响凝胶的性能. 此外，反应介质的pH值对凝胶的形成也有较大的影响，pH 8.0~8.5，凝胶产率最高［6］.

　　3.2凝胶溶胀及药物释放GMAdex/AAc水凝胶对pH值有可逆的溶胀消溶胀响应，这个响应主要受凝胶内部累积的可扩散离子产生的离子渗透压的影响［7］. GMAdex/AAc酸敏水凝胶在SIF缓冲溶液中的溶胀率高于SGF中的，使得药物易于在SIF缓冲溶液中释放出来. 通过对不同配比原料组分的研究，发现随着AAc含量的增大，中性（或碱性）条件下的溶胀率增大，但酸性条件下的溶胀率降低. 也就是说，凝胶的pH敏感性随着AAc含量的增加而增大，因此可通过调节AAc的含量控制凝胶的溶胀与收缩，从而控制药物的释放. 实验中我们发现，不同配比的GMAdex/AAc水凝胶在开始的2 h，在人工肠液中的溶胀率均略高于人工胃液，这可能与人工肠液与胃液不同的离子强度有关. 此外，GMAdex的取代度及凝胶含水率也会影响凝胶的溶胀与药物的释放. DS越大，GMAdex含量越高，溶胀率越低，凝胶体系对pH值的响应性也随之降低；凝胶含水率越高，药物释放速率越快［8］.

　　3.3凝胶降解性近年来，生物可降解材料在药物载体中的应用越来越受到关注［9,10］. DS 10.5的GMAdex在体内dex酶的作用下可完全降解，但GMAdex/AAc酸敏凝胶的降解性还没有得到完全证实，还需要进一步的研究［4］. AAc含量的增加，虽然有利于凝胶体系的pH响应性，但同时也会影响凝胶体系的机械强度及生物可降解性. 另外，我们在选取牛血清白蛋白（BSA）作模型药物时，发现BSA在人工胃液与肠液中的释放没有明显差异，可能是因为BSA分子较大，载药时只能表面吸附，难以通过凝胶进入凝胶内部，提示我们对于大分子药物，应采用包埋的方式载药，而且这类大分子的释放与凝胶的降解有关. 相关研究见后续报道.

　　【】

　　［1］ 吴道澄, 万明习, 吴红. 智能化释药载体纳米凝胶的制备及其释药特性［J］.第四军医大学学报,2001;22(8):767.

　　Wu DC, Wan MX, Wu H. Preparation and release characteristics of intelligent nanogel［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(8):767.

　　［2］ Franssen O, van Ooijen RD, de Boer D, et al. Enzymatic degradation of methacrylated dextrans［J］. Macromolecules, 1997;30(24):7408-7413.

　　［3］ Franssen O, Vandervennet L, Roders P, et al. Degradable dextran hydrogels: Controlled release of a model protein from cylinders and microspheres［J］. J Control Release, 1999;60(23):211-221.

　　［4］ Chiu HC, Wu AT, Lin YF. Synthesis and characterization of acrylic acidcontaining dextran hydrogels［J］. Polymer, 2001;42(8):1471-1479.

　　［5］ van DijkWolthuis WNE, Talsma H, Kettenesvan den JJ, et al. Synthesis, characterization and polymerization of glycidyl methacrylate derivatized dextran［J］. Macromolecules, 1995;28(22): 6317-6322.

　　［6］ Franssen O, Vos OP, Hennink WE. Delayed release of a model protein from enzymaticallydegrading dextran hydrogels［J］. J Control Release, 1997;44(23):237-245.

　　［7］ Chiu HC, Lin YF, Hsu YH. Effects of acrylic acid on preparation and swelling properties of pH sensitive dextran hydrogels［J］. Biomaterials, 2002; 23(4):1103-1112.

　　［8］ Chiu HC, Lin YF, Hsu YH. Effects of acrylic acid on preparation and swelling properties of pHsensitive dextran hydrogels［J］. Biomaterials, 2002;23(4):1103-1112.

　　［9］ Zhang XZ , Wu DQ, Chu CC. Synthesis and characterization of partially biodegradable, temperature and pH sensitive DexMA/PNIPAAm hydrogels［J］. Biomaterials, 2004;25(19):4719-4730.

　　［10］ Zhang Yl, Chu CC. Biodegradable dextranpolylactide hydrogel network and its controlled release of albumin［J］. J Biomed Mat Res, 2001;54(1):1-11.