TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

             作者：王宪锋，刘忠湘，李淑梅，缪军

【关键词】  恶性疟原虫

    Intracellular delivery of TAT fusion protein into erythrocytestage Plasmodium falciparum

　　【Abstract】 AIM: To investigate the transduction of TATp53 fusion protein into erythrocytestage Plasmodium falciparum (P.f). METHODS:  Purified TATp53 protein and p53 protein were respectively incubated with malarial parasite culture for 30 min. The blood smear was prepared and the TATp53 protein was detected by immunofluorescence assay after transduction. The effect of TATp53 on the growth of parasites was determined by counting the parasitemia changes between pre and postincubation of the fusion protein with the parasite culture for 12 h. RESULTS:  TATp53 fusion protein could be transduced into P.f parasites, locating at trophozoit and lateschizont stage, whereas p53 protein could not. No significant difference was found in the parasitemia of P.f culture treated with TATp53 fusion protein and that of control (P>0.05), suggesting that the protein transduction had no effect on the parasite growth. CONCLUSION:  TAT fusion protein can be transduced into P.f parasite, which will provide a useful tool for the investigation of gene function related with malarial parasite.

　　【Keywords】 Plasmodium falciparum; TATp53; protein transduction

　　【摘要】 目的：探讨TATp53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性. 方法：将纯化的TATp53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30 min后，制备血涂片，利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导. 同时融合蛋白与疟原虫共孵育12 h前后的感染率变化，观察蛋白转导对疟原虫生长的影响. 结果：TATp53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜，进入虫体细胞内，并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体，而p53蛋白不能进入疟原虫内. 融合蛋白与疟原虫共孵育12 h后其感染率与对照组之间无显著差异（P>0.05），说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响. 结论：TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内，这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.

　　【关键词】 恶性疟原虫；TATp53融合蛋白；蛋白转导

　　0引言

　　目前疟原虫基因功能研究技术，包括基因敲除，基因置换，基因座位置换，外源基因的表达以及最近建立的疟原虫四环素诱导性转基因表达系统等方法都是建立在基因转染技术的基础上［1-3］，而疟原虫基因转染效率的极度低下［2,4］成为疟原虫转染尤其是稳定转染研究中一个瓶颈因素，到目前为止这方面研究仍然没有突破性的进展. 人类免疫缺陷病毒I (human immunodeficiency virus type 1, HIV1) TAT (transactivator transcription)蛋白的蛋白功能区，即蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）［5］，能够有效的引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能. 我们即将TATp53融合蛋白与红内期恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，P.f)进行共孵育，观察融合蛋白是否能通过疟原虫的多层细胞膜转导入虫体，以期为疟原虫基因功能的研究引入一种新的技术手段.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　恶性疟原虫D10株由德国海德堡大学Dr. Michael Lanzer赠送，参照刘忠湘等［6］的方法进行培养. O+红细胞来自本实验室志愿者，离心去除白细胞后用于疟原虫培养. 纯化的TATp53融合蛋白，p53蛋白，抗p53小鼠血清和抗AMAMSP小鼠血清为本实验室制备. PBS (10×储存液, Na2HPO4・12H2O 40 g, KH2PO4 5 g, NaCl 81 g, 200 g/L NaN3 1 mL, pH 7.2)，羊抗鼠免疫球蛋白为美国Sigma产品.

　　1.2方法

　　1.2.1蛋白转导未经同步化的恶性疟原虫培养物用于转导试验. 96孔板中每孔接种200 μL培养原虫，然后加入纯化的TATp53 15 μL或p53蛋白，轻缓混匀后置于37℃细胞培养箱中继续培养30 min. 将蛋白虫体混合物完全转移至1.5 mL离心管中，加入PBS于6000 r/min离心7 s, 弃上清，用沉积的虫体细胞涂制原虫亚厚血涂片用于间接免疫荧光分析.

　　1.2.2间接免疫荧光分析涂制的疟原虫血涂片浸入预冷的丙酮溶液中固定5 min，空气干燥. 为限定反应范围，每张涂片中用蜡笔画3个圆圈，每个圆圈中加入200 μL用5 g/L BSAPBS稀释(1∶100)的抗p53或AMAMSP小鼠血清，放入湿盒中作用30 min后再浸入PBS于微型振荡器上振动洗涤3×5 min. 然后于每个圆圈中加入200 μL以FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白（PBS 1∶76稀释），于室温作用30 min，同上振动洗涤3×5 min. 滴加500 mg/L甘油封片后荧光显微镜下观察.

　　1.2.3蛋白转导对疟原虫的影响实验中将同一份培养原虫分为3组，即对照组，TATp53处理组和ACD/MCM处理组，每组重复3次. 对照组不经任何处理；TATp53组：疟原虫与TATp53融合蛋白轻缓混匀后继续孵育12 h；ACD/MCM组：参照［6］用枸橼酸葡萄糖抗凝剂（acid citrate dextrose，ACD）与疟原虫完全培养基(complete malariaculture medium，MCM)1∶1混合液处理疟原虫. 作用后计算疟原虫感染率［6］.

　　统计学处理：方差分析和作图均利用GraphPad Prism v4.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA)进行.

　　2结果

　　2.1TAT蛋白转导的检测为观察TAT是否能够有效引导外源蛋白质进入疟原虫虫体内，实验选用疟原虫无关蛋白p53与TAT蛋白转导域融合构成TATp53融合蛋白. 实验中分别以TATp53融合蛋白和p53蛋白与培养疟原虫进行共孵育，然后以TATp53小鼠抗血清进行免疫荧光染色，观察外源蛋白在虫体内的定位. 以抗AMAMSP抗血清在疟原虫血涂片中可以检测到绿色荧光，而红细胞涂片中没有任何荧光出现，表明间接免疫荧光实验操作正确，具有很好的可靠性. 以p53和培养原虫共孵育后，TATp53抗血清杂交后没有发现绿色荧光；而TATp53融合蛋白与原虫共孵育后以TATp53抗血清可以检测到绿色荧光(Fig 1)，说明TATp53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜，进入虫体细胞内. 从荧光照片中可以看到，荧光主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体，并且可以根据荧光观察到晚期裂殖体中的裂殖子. 该结果提示TATp53融合蛋白不但可以进入疟原虫细胞内，而且可以穿过多层细胞膜，最后进入细胞核内.

　　2.2蛋白转导对疟原虫的影响为观察蛋白转导对疟原虫生长的影响，将TATp53融合蛋白与疟原虫培养物共孵育12 h后，原虫感染率. 结果发现，在共孵育后疟原虫感染率为(10.23±1.36)%，对照组为(9.67±1.53)%，两者之间没有显著性差异（P>0.05）. 而ACD/MCM处理组的感染率迅速下降到(1.60±0.50)%，与对照组和TATp53融合蛋白处理组相比均具有显著性差异（P<0.05）. 这些结果表明，蛋白转导本身对疟原虫的生长没有影响(Fig 2).

　　3讨论

　　目前疟原虫转染主要采用的还是电穿孔转染法，该方法虫体死亡率高，实验时需要大量培养原虫，耗费大量人血清和红细胞，代价较高［7-9］. VanWye等［4］根据他们的实验结果估计，恶性疟原虫的电穿孔法瞬时转染的效率为1%，变化幅度可能在10倍左右. 而对于稳定转染，其转染效率更低，估计为1/5000［2］. 充分利用TAT的蛋白转导特性，将有效克服以基因转染疟原虫的低效率和稳定转染中的长时间筛选问题，为疟原虫基因功能的研究提供新的技术手段.

　　1988年两个实验室报道了HIV1的反式激活蛋白TAT能够跨膜导入细胞内部［5］. 1994年，Fawell等［10］发现与TAT共价结合的异源蛋白可被其转移到细胞内，即TAT具有蛋白转导活性. 我们以前将TAT与乙肝病毒靶向核糖核酸酶（HBV Targeted Ribonuclease，TR）融合构成TATTR，发现TATTR融合蛋白可以高效导入HepG2.2.15细胞，并且可以有效抑制HBV的生长，HBeAg含量下降60.3%［11］. 疟原虫寄生于红细胞内，从外至内共有红细胞膜，含虫空泡膜，疟原虫细胞膜，疟原虫细胞核核膜等4层生物膜，我们即将疟原虫无关蛋白p53与TAT构成融合蛋白，与培养的红内期疟原虫共孵育，观察融合蛋白是否可以转导进入疟原虫内部. 结果发现TATp53融合蛋白可以转导进入并可以被检测到，而不含有蛋白转导结构域的p53蛋白不能进入. 表明即使是多层膜含有TAT转导域的多肽或蛋白质仍然可以高效转导进入.
实验中还发现，TATp53融合蛋白转导疟原虫时主要进入滋养体和晚期裂殖体，并且可以根据荧光观察到晚期裂殖体中的裂殖子. 由于实验中使用的疟原虫为未经同步化的培养物，而没有发现具有绿色荧光染色的环状体，推测可能是红细胞是终末端分化细胞，裂殖子刚刚入侵红细胞形成环状体时融合蛋白无法转导进入.

　　疟原虫入侵红细胞后寄居于其中，其细胞膜具有一些供营养物质通过的通道，外源蛋白也可能通过这些通道进入，而非TAT结构域的转导功能. 实验中TATp53融合蛋白可以进入疟原虫感染的红细胞，而p53没有进入，这就排除了经过细胞膜通道的可能性.

　　为观察蛋白转导对疟原虫生长的影响，将TATp53融合蛋白与疟原虫培养物共孵育12 h后计算感染率的变化. 结果发现与对照组疟原虫的感染率之间没有显著性差异，说明蛋白转导实验对疟原虫的生长没有影响，在基因功能实验中可以排除转导对结果分析的干扰. 选用的p53蛋白是疟原虫无关蛋白，如果将p53置换为疟原虫相关蛋白，即可以上几种策略进行疟原虫基因功能的研究.

　　【参考】

　　［1］ 王宪锋，缪军，薛采芳. 疟原虫基因转染的研究进展［J］. 寄生虫学与寄生虫病杂志,2000;18(4):236-239.

　　Wang XF, Miao J, Xue CF. Progress in the research on genetic transfection of malaria parasites ［J］. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2000;18(4):236-239.

　　［2］ Crabb BS, Triglia T, Waterkeyn JG, et al. Stable transfection of Plasmodium falciparum ［J］. Mol Biochem Parasitol, 1997;90(1): 131-144.

　［3］ Meissner M, Krejang E, Gilson PR, et al. Tetracycline analogueregulated transgene expression in Plasmodium falciparum blood stages using Toxoplasma gondii transactivators ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005; 102(8):2980-2985.

　　［4］ VanWye JD, Haldar K. Expression of green fluorescent protein in Plasmodium falciparum ［J］. Mol Biochem Parasitol, 1997;87(2): 225-229.

　　［5］ Frankel A, Pabo C. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus ［J］. Cell, 1988;55:1189-1193.

　　［6］ 刘忠湘，王宪锋，李淑梅，等. 枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2004;22(6): 344-348.

　　Liu ZX, Wang XF, Li SM, et al. Effects of anticoagulants based on sodium citrate on the growth activity of malaria parasites ［J］. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2004;22(6): 344-348.

　　［7］ 王宪锋，薛采芳，缪军，等. 我国YN株恶性疟原虫瞬时基因转染系统的建立［J］. 细胞与分子免疫学杂志,2000;16(5): 447-449.

　　Wang XF, Xue CF, Miao J, et al. Establishment for transient transfection system of bloodstage Plasmodium falciparum Chinese strain YN ［J］. J Cell Mol Immunol, 2000;16(5): 447-449.

　　［8］ 王宪锋,缪军,刘忠湘,等. 恶性疟原虫GBP130基因5′近端侧翼序列调控功能的研究［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2002;20(2): 65-71.

　　Wang XF, Miao J, Liu ZX, et al. Functional characterization of the 5′ proximal flanking fragment of Plasmodium falciparum GBP130 gene ［J］. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2002;20(2): 65-71.

　　［9］ 王宪锋,薛采芳,刘忠湘,等. 插入四环素操纵子对恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白130 基因启动子活性的影响［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2004;22(2): 70-75.

　　Wang XF, Xue CF, Liu ZX, et al. Effects of tetracycline operator element insertion on Plasmodium falciparum glycophorin binding protein 130 gene promoter activity ［J］. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2004;22(2): 70-75.

　　［10］ Fawell S, Seery J, Daikh Y. Tatmediated delivery of heterologous protein into cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91:664-668.

　　［11］  Ding J, Liu J, Xue CF. AntiHBV activity of TATtargeted ribonuclease in vitro ［J］. World J Gastroenterol, 2003;9(7):1525-1528.