地塞米松诱导大鼠白内障形态学及酶活性变化
作者：王建伟，严宏，王永强，哈文静，丁正华，郭勇
【关键词】 白内障
Alteration of morphology and enzyme activity in dexamethasoninduced cataract in rat lens
【Abstract】 AIM: To observe the morphological features and enzyme activities in dexamethasoninduced organcultured rat lens and to study the mechanisms of steroid cataract. METHODS: One hundred lenses cultured in vitro were divided into 2 groups: control group (DMEM) and dexamethasoninduced cataract group (DMEM+dexamethason 10 μmol/L). Following incubation, the lenses were evaluated daily using a dissecting microscope. On d 1, 3, 5 and 7, 12 lenses of each group were homogenized and the activities of enzymes (catalase, superoxide dismutase, lactate dehydrogenase) were measured, respectively. Two lenses of each group were made into specimen of transmission electron microscopy for the observation of the ultrastructure on d 7. RESULTS: The lenses of control group exhibited mistlike opacity and those of cataract group had dense nuclear opacity on d 7. On d 3, the activities of catalase, superoxide dismutase and lactate dehydrogenase decreased by 34.51%, 7.78%, 15.73% respectively compared with those on d 1. On d 7, they decreased by 84.54%, 30.17%, 40.93% respectively compared with those on d 1. Under electron microscope, the arrangement of fiber cells in control group was in tidy order and the cell membrane, cell junction and organelle were normal, while in cataract group, the arrangement of fiber cells were in untidy order and the lenses consisted of abnormalappearing cells which exhibited swollen mitochondria, a large amount of vacuoles and expanded extracellular lacunae. CONCLUSION: Lenses have nuclear cataract in dexamethasoninduced organcultured rat lens. Oxidative stress may be involved in the steroidinduced cataract formation.
【Keywords】 glucocorticoid; cataract; catalase; superoxide dismutase; lactate dehydrogenase; transmission electron microscope
【摘要】 目的：观察地塞米松诱导离体大鼠激素性白内障的形态学和酶活性变化，探讨激素性白内障发病机制. 方法：大鼠的100只透明晶状体随机分为对照组（DMEM）、地塞米松诱导的白内障组（DMEM＋地塞米松10 μmol/L），体外培养7 d，动态观察晶状体混浊情况，1,3,5和7 d分别从各组取12只晶状体，测定晶状体中的过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，7 d从各组取2只晶状体做透射电镜，观察晶状体形态学变化. 结果：7 d对照组晶状体呈雾状混浊，白内障组晶状体出现重度核混浊. 培养3 d，CAT,SOD,LDH活性分别下降约34.51%,7.78%,15.73%. 7 d活性分别比第1日下降约84.54%,30.17%,40.93%. 透射电镜观察对照组晶状体纤维细胞层次整齐，细胞膜、细胞连接、细胞器正常. 白内障组纤维细胞排列不齐，细胞间隙增大，线粒体出现空泡变性. 结论：地塞米松可诱导离体大鼠晶状体产生核性白内障，氧化应激可能参与激素性白内障的形成.
【关键词】 糖皮质激素；白内障；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；乳酸脱氢酶；透射显微镜
0引言
白内障是世界首位致盲性眼病，其发生与年龄、近视、糖尿病、长期应用糖皮质激素等多种危险因素有关. 自1960年Black等首次报道激素与白内障的关系以来，随着激素在器官移植、免疫性疾病、和战伤救治等过程中的大量应用，激素性白内障越来越引起人们的重视［1］. 大量的流行病学资料证实长期大剂量全身、眼局部及吸入糖皮质激素治疗均可引起以晶状体后囊下混浊为特征的激素性白内障［2,3］. 而激素性白内障发病的确切机制尚未完全阐明，目前主要形成了氧化损伤学说、离子转运障碍学说、晶状体代谢紊乱学说、蛋白加和物学说、激素通过受体途径而发挥作用的受体学说［4］. 我们通过离体大鼠晶状体的培养，建立激素性白内障的离体模型，动态观测晶状体的混浊程度，利用透射电子显微镜观察激素性白内障晶状体的超微结构改变，测定晶状体中过氧化氢酶（CAT）,超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化，探讨氧化损伤在激素性白内障中的作用.
1材料和方法
1.1材料
健康清洁级SD大鼠54只（第四军医大学实验动物中心提供），雌雄不限，鼠龄4 wk，体质量70~90 g. 地塞米松为美国Sigma公司产品，CAT,SOD,LDH测试盒购自南京建成生物工程研究所.
1.2方法
1.2.1离体晶状体培养以颈椎脱臼法处死SD大鼠，取其眼球，剔除肌肉、筋膜等组织，安尔碘浸泡5 min，生理盐水冲洗3次，将眼球浸于DMEM液中，由后极部剪开巩膜，取出晶状体. 尽量去除晶状体表面的玻璃体. 将晶状体放入含5×104 u/L青霉素和5×104 u/L链霉素的DMEM培养基中，于37℃下，置50 mL/L CO2细胞培养箱中培养8 h后，弃去混浊晶状体，留取100只透明晶状体备用.
1.2.2激素性白内障模型的建立［5］将100只备用晶状体按随机数字大小等分为两组：正常对照组（A:DMEM），地塞米松诱导的激素性白内障组（B:DMEM+地塞米松10 μmol/L）. 分别放入含培养基的无菌24孔板中，于37℃下，置50 mL/L CO2细胞培养箱中培养，隔日换液. 培养中每日用解剖显微镜观察晶状体，记录晶状体混浊程度. 各组分别于第1,3,5,7日取出12只晶状体，称质量，-70℃冰箱冷冻保存.
1.2.3晶状体混浊程度的动态观察利用解剖显微镜，每日观察、记录晶状体混浊程度. Mathur等［6］离体晶状体混浊的分级方法，将晶状体混浊程度分为0~5级，0级=透明晶状体，1级=晶状体呈雾状混浊，2级=晶状体皮质和核之间出现可见分界，3级=轻度晶状体核混浊，4级=重度晶状体核混浊，5级=晶状体完全混浊（Fig 1）.
1.2.4酶活性测定分别于第1,3,5,7日，从各组中取12只晶状体，按50 g/L (W/V)的量加入冷生理盐水，用匀浆机Heidolph DIAX900粉碎，3000 r/min离心15 min，取上清测定CAT, SOD和LDH活性，实验中严格按测试盒说明的实验步骤操作.
1.2.5电镜检查各取两组培养7 d的晶状体2只，放入40 g/L戊二醛固定液中固定24 h，用磷酸盐缓冲液冲洗，以10 g/L锇酸固定1 h，乙醇丙酮系列梯度脱水，环氧树脂812包埋、聚合，LKB型超薄切片机切片，铅铀双重染色，透射电子显微镜JEM100SX下观察超微结构.
统计学处理：使用SPSS 12.0统计软件，对等级资料采用Wilcoxon秩和检验，定量资料采用析因设计方差分析进行不同时间及组间比较.
2结果
2.1晶状体混浊情况的动态观察随作用时间延长，实验组大鼠晶状体的混浊程度逐渐加重. 培养1 d，白内障组显微镜下见部分晶状体呈雾状混浊， 2 d部分晶状体皮质和核之间出现可见分界，大多晶状体呈雾状混浊， 3 d出现轻度晶状体核混浊，6 d出现重度晶状体核混浊，7 d有晶状体完全混浊. 对照组，晶状体可保持4 d完全透明，4 d开始有少量晶状体出现雾状混浊，6 d少量晶状体皮质和核之间出现可见分界（Fig 1）.
从培养2 d起，两组晶状体混浊程度间差异有显著性意义（P<0.05），随培养时间延长，白内障组晶状体混浊加重，7 d大多晶状体表现为重度核混浊，而对照组晶状体基本透明，呈雾状混浊（Tab 1）.表1晶状体混浊的动态观察（略）
2.2酶活性检测在培养第1日，三种酶活性在对照组与实验组之间差异均无统计学意义，随培养时间的延长，两组间酶活性差异具有显著性意义. 酶活性随时间有不同程度下降，而对照组酶活性随时间变化差异无统计学意义. CAT活性在培养第3日比第1日下降约每克蛋白724.15 nkat （P<0.01），约下降34.51%，随培养时间延长，酶活性进一步下降，第7日酶活性比第1日下降每克蛋白1774.19 nkat（P<0.01），约下降84.54%（Fig 2）. SOD活性于第3日少量下降约每毫克蛋白24.17 nkat，下降约7.78%，第5日比第1日下降约每毫克蛋白61.85 nkat，表现出显著性差异 （P<0.05），第7日继续下降，活性比第1日下降约30.17% （P<0.01，Fig 3）. 培养第3日 LDH活性比第1日下降约每毫克蛋白4.5 nkat （P<0.01），下降约15.73%，随时间延长，实验组酶活性继续下降，第7日比第1日下降40.93%（Fig 4）.
2.3超微结构观察透射电镜观察晶状体标本（Fig 5），对照组晶状体细胞层次整齐（Fig 5A），细胞间可见紧密连接（Fig 5B），细胞器少见，线粒体形态正常. 白内障组晶状体细胞层次紊乱（Fig 5C），晶状体纤维失去正常结构，有的断裂、崩解. 细胞间隙加宽（Fig 5D），线粒体出现肿胀、空泡变性（Fig 5E）.
3讨论
糖皮质激素已广泛运用于临床，但长期使用糖皮质激素是形成后囊下白内障的重要危险因素，从而限制了糖皮质激素在全身或眼部炎症中的应用. 目前晶状体混浊的机制未完全阐明，由于难以建立合适的动物及离体实验模型，限制了在这一领域的研究，因而除手术摘除白内障，尚无有效的方法.
Nishigori等［7,8］率领的课题组自上世纪80年代起，建立和了鸡胚的激素性白内障模型，对激素性白内障的发病机制进行了系列研究，提出了氧化损伤学说. 目前激素性白内障的动物、离体实验模型得到进一步发展，有力解决了实验研究中的一大难题. 我们在培养介质DMEM中加入10 μmol/L的地塞米松培养7 d，诱发出离体大鼠的核性白内障. 超微结构观察，发现激素性白内障晶状体的细胞间紧密连接被破坏，细胞间隙变宽，缝隙连接消失，内含变性的线粒体及空泡，这与Dunia等［9］的观察一致. 晶状体纤维排列紊乱，纤维绝大部分失去正常结构，呈断续状，有的纤维断裂、崩解. 但核性白内障与后囊下白内障有差异，可能是由于动物种属、离体与活体实验之间的差异，这也是离体研究的一大难题，尚需进一步探索更为接近的离体模型.
CAT,SOD在晶状体抗氧化酶系统中起重要作用［10］，LDH是糖酵解的关键酶，晶状体上皮的能量主要通过葡萄糖无氧酵解获得，占晶状体ATP总量的3/4，是晶状体的主要能量来源. 我们实验的结果显示，在地塞米松诱导的激素性白内障中，随培养时间的延长，白内障混浊程度加重，CAT,SOD和LDH活性均显著下降. 糖皮质激素削弱晶状体抗氧化的防御屏障及晶状体代谢发生改变，能量供应不足，产生氧化应激，致晶状体细胞结构损害和功能代谢障碍，发生晶状体混浊.
激素性白内障形成后囊下混浊的机制复杂，在这一领域已进行了大量的研究，然而独特的临床表现仍难以某一种假说解释. 我们通过建立地塞米松诱导的离体大鼠核性白内障模型，检测酶活性的变化，推测氧化应激可能参与了激素性白内障的形成，为进一步研究激素性白内障的发病机制，筛选可能的药物，提供线索.
【】
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