辛基酚对MDA

        作者：彭俊华，张峰，张华欣，张全华，赵勇，贺晓倩

【关键词】  ,细胞增殖;,,乳腺癌;,辛基酚；细胞周期蛋白D1;细胞周期蛋白质依赖激酶类

　　Effects of octylphenol on cell cycle and cyclin expression of MDAMB231 breast cancer cells

　　【Abstract】  AIM:  To observe the effects of octylphenol (OP) on cell cycle and cyclin expression of MDAMB231 breast cancer cells and to probe the molecular mechanisms of OP inhibiting MDAMB231 breast cancer cell proliferation. METHODS: The changes of cell proliferation, cell cycle, cyclinD1 mRNA, cyclinD3 mRNA, CDK2 mRNA, CDK4 mRNA and cyclinD1 protein expressions of MDAMB231 cells treated with OP were observed by using MTT test, flow cytometry, immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS:  When MDAMB231 breast cancer cells were treated with 4 or 8 μmol/L OP for 48 h, the cell inhibition rates were (17.13±4.1)%, (40.25±8.7)%, and the fluorescence values of cyclin D1 were 55.1±10.2, 41.4±11.2, significantly decreased as compared with control group(89.9±11.2, P<0.05). When MDAMB231 breast cancer cells were treated with 8 μmol/L OP for 24 and 72 h, the cell ratios in the G0/G1 phase were (67.0±17.6)% and (44.4±11.9)%，significantly increased as compared with control group［(46.6±12.8)% at 24 h, (15.3±3.1)% at 72 h, P<0.05］. OP inhibited the mRNA expressions of cyclin D1, cyclin D3, CDK2 and CDK4 and the protein expression of cyclin D1. CONCLUSION： OP can inhibit the proliferation of MDAMB231 breast cancer cells, which may be related to downregulating the expressions of cyclin D1, cyclin D3, CDK2 and CDK4 mRNA and cyclin D1 protein.

　　【Keywords】  cell proliferation; breast neoplasms; octylphenol ; cyclinD1； cylindependent kinases

　　【摘要】 目的:  观察辛基酚(OP)对细胞周期及周期蛋白表达的影响，探讨OP抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖的可能分子机制. 方法： 以MTT试验、流式细胞分析、免疫细胞化学和RTPCR等方法观察OP对MDAMB231乳腺癌细胞增殖、细胞周期、CDK2，CDK4，cyclin D1和cyclin D3表达的影响. 结果： 4, 8 μmol/L OP作用MDAMB231乳腺癌细胞48h时，其抑制率为(17.1±4.1)%, (40.3±8.7)%，cyclin D1表达量荧光值为55.1±10.2，41.4±11.2，比对照组(89.9±11.2)明显降低(P<0.05). 8 μmol/L OP作用MDAMB231乳腺癌细胞24 h和72 h，G0/G1期细胞为(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期细胞比对照组［24 h，(46.6±12.8)%；72 h，(15.3±3.1)%］明显增高(P<0.05). OP导致MDAMB231乳腺癌细胞中CDK2，CDK4，cyclin D1和cyclin D3 mRNA的表达降低，且cyclin D1蛋白的表达也降低. 结论： OP能抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖，其机制可能与OP能降低乳腺癌细胞中CDK2，CDK4，cyclin D1和cyclin D3 mRNA及其蛋白的表达有关.
 
　　【关键词】 细胞增殖;  乳腺癌; 辛基酚；细胞周期蛋白D1;细胞周期蛋白质依赖激酶类

　　0引言

　　辛基酚（octylphenols, OP）是一种环境雌激素，近年来对它的雌激素活性检测及其生殖毒性效应研究较多［1］. OP能促进ERα+  MCF7乳腺癌细胞的增殖，表现雌激素活性，却抑制ERα-  MDAMB231乳腺癌细胞的增殖［2］. 细胞增殖与细胞周期密切相关，本研究将OP作用于MDAMB231乳腺癌细胞，观察细胞的增殖和CDK2, CDK4, cyclin D1，cyclin D3表达的改变，探讨OP影响MDAMB231乳腺癌细胞增殖的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料试剂中，OP纯度>98%，sigma产品. cyclinD1抗体为兔抗人抗体，使用浓度为1∶75倍稀释，FITC标记羊抗兔抗体，北京中杉产品. RTPCR试剂盒，上海sangon产品. 二甲亚砜(DMSO)，纯度>98%，进口分装试剂，用于配制OP.  MDAMB231乳腺癌细胞由中科院上海细胞所提供. 实验前将MDAMB231乳腺癌细胞在无酚红的DMEM/F12中培养24 h以耗尽细胞的内源性雌激素，然后以该培养基进行实验. 实验分为3组：对照组，给予DMSO；4 μmol/LOP组；8 μmol/L OP组.

　　1.2方法

　　1.2.1MTT试验以492 nm波长测定活细胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(对照组A值- 实验组A值)/对照组A值×100%，每次试验设2个平行孔，试验重复3次［3］.
 
　　1.2.2细胞周期相及凋亡检测实验各组细胞处理24, 48和72 h，收获细胞，700 mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，每次试验设2个平行孔，试验重复3次.
 
　　1.2.3cyclin D1表达分析细胞生长于小盖玻片上，多聚甲醛固定，血清封闭，加一抗于37℃孵育50 min，加荧光素标记二抗孵育20 min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦显微镜观察、照相及数据分析，实验重复2次. 荧光强度时每组实验取3张片子，每张片子取36个视野，每个视野取5个细胞，计算其平均荧光强度.
 
　　1.2.4RTPCR检测CDK2, CDK4, cyclin D1, cyclin D3的mRNA表达实验各组细胞处理24 h，收获细胞，用Trizol试剂一步法提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，置-80℃备用. 引物由上海sangon合成，CDK2：F  5′GCT CTC ACT GGC ATT CCT CCT 3′，R  5′ 5′CGA AAT GAA GGC ACT AGA GC3′，产物546 bp；CDK4：F  5′CTA CCT CTC GAT ATGAGC CAG T 3′，R  5′CAT CTG GTA GCT GTA GAT TCT G3′，产物563 bp；cyclin D1：F  5′GAG GAA CAG AAG TGC GAG GA 3′，R  5′TCT GGA GAG GAA GCG TGT GA3′，产物501 bp；cyclin D3：F  5′TGT CAG GAG CAG ATC GAA GC 3′，R  5′CCT TTA GAA GGC ACT AGA GC3′，产物453 bp；βactin：F  5′AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT 3′，R  5′GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT3′，产物202 bp. 25 μL体系加样本总cDNA，上游和下游引物各1.5 μL，依次加入试剂盒其他成分. 反应条件为94℃灭活40 s，60℃或61℃退火40 s，72℃延伸40 s，22个循环，20 g/L琼脂糖电泳，照相，半定量分析以凝胶成像系统的分析软件Q1来分析其灰度值，每实验重复3次，以目的条带/βactin之比值为结果，各组间进行单因素方差分析.
 
　　统计学处理：数据用x±s表示，组间比较用SPSS10.0软件进行单因素方差分析.

　　2结果

　　2.1MDAMB231乳腺癌细胞增殖以4, 8 μmol/L  OP作用MDAMB231乳腺癌细胞48 h，细胞抑制率为(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.
 
　　2.2MDAMB231乳腺癌细胞周期相分布8 μmol/L OP作用MDAMB231乳腺癌细胞24 h和72 h， G0/G1期细胞分别为(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期细胞比对照组［24 h，(46.6±12.8)%；72 h，(15.3±3.1)%］明显增高(P<0.05).

 
　　2.3MDAMB231乳腺癌细胞中cyclin D1蛋白表达cyclin D1蛋白主要表达于细胞的胞浆中(图1)，4, 8 μmol/L OP组cyclin D1表达量荧光值分别为55.1±10.2，41.4±11.2，比对照组(89.9±11.2)明显降低(P<0.05).

　　A： 对照组；B： 4 μmol/L OP组；C：  μmol/L OP.
 
　　图1OP对MDAMB231乳腺癌细胞中cyclinD1表达的影响SPFITC ×400  （略）

　　2.4MDAMB231乳腺癌细胞中CDK2, CDK4, cyclin D1, cyclin D3 mRNA表达mRNA的表达以电泳条带的亮度来判断，亮度值越强，mRNA量越高，经凝胶成像系统软件处理，与对照组比较，OP组CDK2, CDK4, cyclin D1及cyclin D3 mRNA表达均降低(图2).

　　M:  marker;  1:  8 μmol/L OP;  2:  4 μmol/L OP; 3:  对照. aP<0.05 vs对照.
 
　　图2OP对 MDAMB231乳腺癌细胞中cyclin D3, cyclin D1, CDK2, CDK4 mRNA表达的影响（略）

　　3讨论

　　雌激素是哺乳动物体内分泌的一种性激素，起着调节动物生长、分化和生殖的作用. OP是一种苯环类化合物，能与ERα结合，显示出雌激素活性. OP主要用于生产非离子表面活性剂、增塑剂、热稳定剂、光稳定剂等，广泛存在于生活、工作环境的水体、淤泥、土壤和食物如鱼类、贝类及饮用水中［4］. MDAMB231乳腺癌细胞是一株ERα-的细胞，>15 μmol/L OP对MCF7乳腺癌细胞会产生毒性作用，1~10 μmol/L OP会对MDAMB231乳腺癌细胞产生毒性效应，抑制MDAMB231乳腺癌细胞的增殖［1］. 以植物雌激素三羟异黄酮作用184B5/HER细胞，结果发现活细胞数量减少，呈剂量效应关系，同时G0/G1期细胞增高，细胞凋亡也增多. 本研究结果显示4，8μmol/L OP均能抑制MDAMB231乳腺癌细胞增殖，并呈时间效应和剂量效应.
 
　　细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，该过程受G1/S，G2/M两个关健点调控. 植物雌激素三羟异黄酮能将MDAMB231乳腺癌细胞阻滞于G2/M期，细胞凋亡增加［5］，超二倍体增加. 本研究结果显示OP作用MDAMB231乳腺癌细胞24h，G0/G1期细胞(凋亡峰)明显增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，细胞迅速凋亡. OP引起MDAMB231乳腺癌细胞周期阻滞与三羟异黄酮不同，这可能与三羟异黄酮具有多种生物活性有关.
 
　　细胞增殖依赖于细胞周期的顺利进行，细胞周期的正常进行又依赖于细胞周期调控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及细胞周期依赖性激酶(CDK)的正常表达. cyclin D CDK4是G0/G1期的限速步骤，过度表达G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速细胞快速通过G1期. cyclinD1蛋白表达与细胞周期运行有关［6］，抑制肿瘤组织生长与P53的高表达及cyclin D1低表达相关［7］. 以17羟雌二醇作用雌性 Wistar大鼠60 d，发现雌二醇通过减少CDK2，CDK4的表达以及降低CDK2活性，将细胞阻滞于G1/S期［8］. 本研究结果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌细胞后，能降低CDK2, CDK4, cyclin D1及cyclin D3 mRNA的表达，降低cyclin D1蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖，细胞阻滞于G1/S期，导致MDAMB231 乳腺癌细胞的增殖受抑，并呈剂量效应和时间效应.

　　【】

　　［1］ Yoshida M, Takenaka A, Katsuda S, et al. Neonatal exposure to ptertoctylphenol causes abnormal expression of estrogen receptor alpha and subsequent alteration of cell proliferating activity in the developing Donryu rat uterus ［J］. Toxicol Pathol, 2002,30(3):357-364.

　　［2］ Verma SP, Goldin BR. Effects of soyderived isoflavonoids on the induced growth of MCF7 cells by estrogenic environmental chemicals ［J］. Nutr Cancer, 1998,30(3):232-239.

　　［3］ 艾金霞，刘良，王冰梅. SBHL对Hela细胞生长抑制作用的影响［J］. 第四军医大学学报，2004, 25(19):1791-1793.

　　［4］ 彭俊华，张峰.  辛基酚对机体健康的影响及其机理的研究进展［J］. 西北国防医学杂志，2004,25(6):445-446.

　　［5］ Po LS, Chen ZY, Tsang DS, et al. Baicalein and genistein display differential actions on estrogen receptor (ER) transactivation and apoptosis in MCF7 cells ［J］. Cancer Lett,  2002, 187(12): 33-40.

　　［6］ 黄安汤, 章翔, 曹云新, 等. cyclin D1在胶质瘤细胞系中表达分布模式初步［J］. 第四军医大学学报，2003, 24(22):2024-2026.

　　［7］ Umemura S, Takekoshi S, Suzuki Y, et al. Estrogen receptornegative and human epidermal growth factor receptor 2negative breast cancer tissue have the highest Ki67 labeling index and EGFR expression: gene amplification does not contribute to EGFR expression ［J］. Oncol Rep,  2005,14(2):337-343.

　　［8］ Koroxenidou L, Ohlson LC, Porsch Hallstrom I. Longterm 17alphaethinyl estradiol treatment decreases cyclin E and cdk2 expression, reduces cdk2 kinase activity and inhibits S phase entry in regenerating rat liver ［J］. J Hepatol, 2005,43(3):478-484.