新西兰兔脊髓内水通道蛋白
作者：孙国柱，张庆俊，赵宗茂，张更申，王浩
【关键词】 水孔蛋白
Expression and distribution of aquaporin4 in spinal cord of New Zealand rabbits
【Abstract】 AIM: To examine the expression and distribution of aquaporin4(AQP4) in normal spinal cord of rabbits, so as to provide theoretical basis for the role of AQP4 in spinal water transport and balance regulation. METHODS: Immunohistochemistry and in situ hybridization were performed on spinal paraffin sections from healthy adult rabbits to detect the expression and distribution of AQP4 protein and mRNA. RESULTS: The positive cells mostly included ependymal cells of myelocoele, glial cells, anterior horn motor neurons, and epithelial cells of spinal pia mater and their expressions were mainly located on cell membrane. Interestingly, AQP4 distribution in glial cells and ependymal cells showed certain directivity, but the former was mainly in the membrane side contacting with capillary endothelial cells and the latter mostly in the basolateral membrane of ependymal cells. CONCLUSION: AQP4 is widely expressed in rabbit spinal cord and its anatomical locations suggest the AQP4 may be involved in spinal cord water transport and balance regulation and electrolyte metabolism, even can be locally regulated to meet special functional request.
【Keywords】 aquaporin4; rabbitss; spinal cord; immunohistochemistry; in situ hybridization
【摘要】目的： 探讨正常新西兰大白兔脊髓水通道蛋白4(AQP4)的定位与表达，为研究其在脊髓水代谢中的作用提供理论基础. 方法： 选用正常成年新西兰大白兔，采用免疫组化和原位杂交技术检测脊髓AQP4蛋白及其mRNA的定位及表达. 结果： 免疫组织化学染色和原位杂交结果显示胶质细胞、前角运动神经元、中央管室管膜细胞、软脊膜上皮细胞均表达阳性，AQP4主要分布于细胞膜，其中，胶质细胞和中央管室管膜细胞表达存在极性，前者主要分布在与毛细血管内皮细胞接触的一侧，后者主要分布在中央管室管膜细胞的基底侧膜. 结论： AQP4在正常兔脊髓内具有广泛的表达，其表达的解剖定位提示AQP4在脊髓内主要参与水分子的转运及平衡调节、电解质代谢，并受局部调节以适应特殊的功能需求.
【关键词】 水孔蛋白4；兔；脊髓；免疫组织化学；原位杂交
0引言
水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一种疏水性膜蛋白家族，自1988年第一个AQP被发现［1］并于1997年正式命名为AQP1以来，目前已经发现11种之多. AQP广泛存在于动、植物的细胞膜上，介导调节水分子的跨膜转运［2-3］. 其中，AQP4在中枢神经系统表达最为丰富，研究证实其在脑内主要分布于星形胶质细胞、软脑膜、室管膜、脉络丛以及下丘脑的视上核和室旁核等部位，参与了水分子的转运及平衡调节（如脑脊液的生成、重吸收）、电解质代谢和内分泌活动［4］. 但有关AQP4在脊髓的定位、表达和功能的研究有限，特别是在正常新西兰大白兔脊髓的分布少见报道. 为此，我们应用免疫组化和原位杂交技术研究AQP4在新西兰大白兔脊髓的定位，推测其可能的生理功能，并为AQP4在脊髓病态的表达提供有益的对比资料.
1材料和方法
1.1材料成年健康新西兰大白兔6只(河北医科大学实验动物中心)，雌雄各3只，体质量1.5～2.0 kg. 一抗为鼠抗AQP4多克隆抗体（1∶200, Sigma公司）. SABC免疫组化试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司). AQP4原位杂交检测试剂盒(武汉博士德公司).
1.2方法
1.2.1标本的制备在氯胺酮过度麻醉下剪开动物胸腔，经心脏灌注生理盐水500 mL至流出液清亮后给予灌注40 g/L多聚甲醛PBS缓冲液(pH 7.3)500 mL. 先快后慢，灌注固定后经后正中切口、咬除棘突和椎弓根，取颈、胸、腰段脊髓各2小段，其中各脊髓节段1小段置入相同固定液中后固定24 h用于免疫组化，剩余各脊髓节段置入相同固定液中后固定2 h用于原位杂交. 后固定成功后用蒸馏水清洗12 h，逐级梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4 μm切片并裱于经10 g/L多聚赖氨酸处理的清洁载玻片，用于免疫组织化学和原位杂交检测.
1.2.2免疫组织化学检测按免疫组织化学常规步骤进行. 切片于新鲜配制的30 mL/L H2O2室温浸泡10 min以灭活内源性过氧化物酶；滴加正常山羊血清30 min；滴加一抗抗人AQP4，37℃恒温孵育2 h , PBS洗；滴加二抗生物素化羊抗兔IgG室温下30 min，滴加试剂SABC，室温30 min；DAB显色，室温20 min；脱水、透明，中性树胶封片. 染色对照： 同一组片中分别用正常山羊血清和PBS代替AQP4一抗作孵育，其余步骤同上.
1.2.3AQP4 mRNA原位杂交按原位杂交检测试剂盒说明书进行. 切片用40 mL/L多聚甲醛(内含1 mL/L DEPC)固定30 min后入3 mL/LPBSH2O2 30 min以除去内源性过氧化物酶活性；然后胃蛋白酶37℃消化5 min, 40 mL/L多聚甲醛终止反应5 min；每张切片滴加含2 mg/L AQP4 mRNA地高辛标记探针的原位杂交液30 μL，置湿盒中42℃杂交20 h；分别用37℃预热的2×SSS，0. 1×SSS洗涤5 min×3, 10 min×2；滴加小鼠抗地高辛抗体37℃ 2 h, 0. 5 mol/L TBS洗涤5 min×3；滴加生物素化羊抗小鼠IgG 37℃ 1 h, 0. 5 mol/L TBS洗涤5 min×3；滴加ABS 37 ℃30 min. DAB显色，脱水，透明，中性树胶封片. 阴性对照：分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗体IgG进行孵育.
2结果
2.1免疫组化检测在脊髓灰质，AQP4阳性着色看起来弥散于整个神经毡，只有神经元胞质不着色，细胞轮廓清楚（图1）. 着色浓度最深的是位于后角的第I，Ⅱ板层，自背侧向腹侧存在着浓度梯度递减的变化趋势，到了中间带和前角AQP4着色中等，但后角颈部的内层部分（第Ⅳ板层），中央管周围区域（第X板层）和胸段的中间外侧柱着色仍深. 在白质，AQP4免疫阳性着色集中在起自灰质并向脊髓表面放射的纤维胶质突起上（图2），主要是星形胶质细胞的突起表达浓郁，或定向放射，或沿脊髓的外界和围绕血管形成胶质膜. 脊髓软脊膜上也呈阳性表达. AQP4的分布除了较少差别外，在所有脊髓节段中均具有可比性并且呈粗略的线形分布. 脊髓AQP4的阳性表达主要位于胶质细胞、神经元的细胞膜上： 灰质内的星形胶质细胞有强阳性着色，以细胞膜着色为主，脊髓前角运动神经元胞膜也有阳性着色（图3A）. 中央管室管膜上皮细胞呈阳性表达，以靠细胞膜基底侧较明显，部分室管膜细胞呈较深的整个胞膜着色（图3B）. 脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、脊髓表面软脊膜上皮细胞的细胞膜也呈强阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得尤为突出（图3C）. 胶质细胞和中央管室管膜上皮细胞着色具有一定的极性分布，前者主要分布于与毛细血管接触的一端，后者主要分布在靠近基底侧处. 上述分布现象在脊髓不同节段无明显差异.
图1新西兰兔颈髓AQP4的表达SABC ×16（略）
图2新西兰兔脊髓白质侧素AQP4的阳性表达SABC ×400（略）
2.2AQP4 mRNA原位杂交检测AQP4 mRNA在脊髓神经元和胶质细胞均有表达. 在灰质内，神经元、胶质细胞胞质内均有不同程度深色的棕色或棕褐色颗粒，未检测到胞核中有杂交信号（图4A）. 其中，中央管室管膜细胞和位于后角的胶质细胞均呈强阳性表达（图4B）. 白质内胶质细胞也呈强阳性表达（图4C）.
A：颈髓灰质前角;B: 脊髓中央管室膜细胞;C: 脊髓侧索中围绕血管的星形胶质细胞终足.
图3新西兰兔AQP4的表达SABC ×400（略）
A： 脊髓前角灰质;B：脊髓后角灰质; C: 脊髓白质侧索.
图4新西兰免AQP4mRNA的阳性表达DAB ×200（略）
3讨论
由于脊髓生理功能的重要性，许多学者对AQP4在其中的分布进行了研究，尽管发现AQP4在脊髓的表达分布于灰质和邻近脊髓血管上皮细胞的胶质细胞的突起，但具体的神经解剖定位未见报道［5-6］. 我们应用免疫组化及原位杂交技术发现，AQP4在整个脊髓均有表达，包括神经元和胶质细胞，主要为细胞膜着色，特别是邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得尤为突出. 根据形态学观察，灰质中AQP4表达阳性的胶质细胞可能是原浆性星形细胞，白质中者为纤维性星形胶质细胞. 灰质AQP4密集着色大部分也源于其在围绕毛细血管的星形胶质细胞足突的着色，并被免疫胶体金技术所证实［7］，有人认为其参与形成血脑屏障［8］. Solenov等［9］证实了AQP4敲除小鼠脊髓后角深层的渗透膨胀比率明显降低，而急性脊髓损伤水肿以灰质最为突出，也就是说，AQP4的表达模式与脊髓水肿定位一致. 表明AQP4在脊髓的水平衡中发挥了重要作用.
我们发现，AQP4表达的一个特点是位于脊髓组织－液体接触的部位：即中央管室管膜上皮细胞和沿软膜排列的胶质细胞AQP4表达丰富，室管膜细胞的阳性着色主要位于基底侧膜，这一发现与Rash等［10］所描述的大鼠脊髓室管膜免疫胶体金AQP4标记一致. 与其他上皮组织不同，室管膜细胞没有基底膜，取而代之的为其下胶质细胞的胶质膜形成基底侧膜. 同样的解剖结构也存在脊髓表面的软膜和神经胶质膜之间的连接. 这些解剖特点提示AQP4在调节脊髓及其周围脑脊液之间水的转运可能起重要作用. 我们还发现，分布于面向毛细血管内皮细胞和软脊膜侧胶质细胞和前角运动神经元细胞膜上的AQP4在组织解剖分布上与K+通道相一致，Walz［11］和Nagelhus等［12］的研究资料也证实了相同极性分布现象. 当神经细胞受到刺激产生动作电位时，细胞外间隙K+浓度将升高，升高的K+将被主要集中在胶质细胞的足突膜上K+通道所分流，但K+的流动必将伴随水分子的流动，以代偿因K+流动所引起的渗透压的变化. 由此推测，AQP4可能在功能上参与调节细胞外K+，水的代谢.
AQP4表达的另一个突出特点是脊髓灰质呈明显的板层差异性分布： 后角最浅表的I，II板层表达最为强烈，而中间带灰质较弱，前角中等. 这种板层分布的差异性并不能单纯为星形细胞密度所解释. 例如，新皮层和海马观察到AQP4强度相当，但后者星形细胞密度较高. 可能原因有： ① 脊髓后角的I, II板层中的神经元主要为中、小型细胞，胞体不足神经元胞体的6%，其余为大量的树突丛与胶质细胞及其树突丛，它们之间形成广泛、密集的突触联系，AQP4着色也就最为强烈；② 后角接受谷氨酸能神经纤维的传入，谷氨酸是伤害性和非伤害性初级传入纤维、后角中间神经元的神经递质，这些神经纤维平时就进行着大量较强而复杂的神经电活动，局部细胞内外电解质、水分子转运活动频繁，AQP4的需要量较大. 即脊髓的板层样AQP4表达可能受局部调节以适应特殊的功能需求. 总之，我们的研究提示，AQP4参与了脊髓水分子转运及平衡调节、电解质代谢，并且其表达受局部调节以适应特殊的功能需求，但具体调节机制还需进一步研究.
【】
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