大鼠INS
作者：张春举，袁栎，周锦勇，德伟
【关键词】 胰岛素
Regulation of IGFBP2 gene expression in rat insulin producing cell line INS1
【Abstract】 AIM: To study the effects of glucose, insulin and growth hormone (GH) on expression of IGFBP2 (insulinlike growth factor binding protein 2) mRNA in INS1 cell line and to analyze the mechanism of IGFBP2 regulation. METHODS: Northern blot analysis was performed for the expression of IGFBP2 mRNA and enzymelinked immunoadsorbent assay for the determination of insulin release in this cellline. RESLUTS: Northern blot analysis showed that different glucose concentration could make a discordant effect on IGFBP2 gene expression. The secretion of insulin increased and the expression of IGFBP2 mRNA was suppressed when cells were kept at high glucose concentration. On the contrary, IGFBP2 mRNA could be well detected in cells that were kept at low glucose while the insulin secreted normally. After 16h incubation, exogenous GH inhibited the expression of IGFBP2 and at the same time the secretion of insulin increased. The expression of IGFBP2 mRNA was inhibited by exogenous insulin at a low glucose concentration condition. CONCLUSION: The effects of glucose and GH on the expression of IGFBP2 mRNA are inhibited by insulin.
【Keywords】 insulinlike growth factorbinding protein 2; RNA, messenger; insulin; glucose; growth hormone; INS1 cell
【摘要】 目的： 研究大鼠胰腺肿瘤β细胞（INS1）中, 葡萄糖(Glucose)、胰岛素(Insulin)和生长激素（GH）对胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP2)基因的表达调控，探索IGFBP2基因调节机制及其在维持正常胰腺细胞生理功能中的作用. 方法： RNA印迹法（Northern blotting）检测INS1细胞IGFBP2 mRNA的表达, 酶标法测定INS1细胞胰岛素分泌量. 结果: 葡萄糖对IGFBP2 mRNA调节作用不同; 高浓度(10mmol/L)葡萄糖条件下，胰岛素分泌量增加，而IGFBP2 mRNA表达被抑制；低浓度(1~5.6 mmol/L)葡萄糖条件下，胰岛素分泌量无显著性变化，IGFBP2 mRNA正常表达. INS1细胞在不完全培养液中，加入GH培养，在不同时间间隔提取培养液进行IGFBP2 mRNA检测，结果发现，培养16 h以上，IGFBP2 mRNA表达开始显著下降. 外源胰岛素抑制IGFBP2 mRNA的表达. 结论： 葡萄糖和生长激素对INS1细胞中IGFBP2 mRNA表达的抑制作用是通过胰岛素调控的.
【关键词】 胰岛素样生长因子结合蛋白质2；RNA，信使；胰岛素；葡萄糖；生长激素；INS1细胞
0引言
在体内生长激素和催乳素等对胰腺β细胞具有促进细胞增生和胰岛素分泌的作用［1］, 同样, 葡萄糖可促进胰岛素分泌［2］. 另外， 胰岛细胞中存在着胰岛素样生长因子（Insulinlike growth factors, IGFs），对细胞增生和分化有促进作用，通过内分泌 、自分泌和旁分泌三种形式作用于细胞. IGFI在胰岛α细胞中表达［3］. IGFII基因在胎儿期多数组织中和胰腺β细胞中表达，在胰腺β细胞中存在着胰岛素、IGFI和IGFII受体［4］. IGFs根据不同靶器官与相应的特异性蛋白结合（IGFBPs, IGF Binding Proteins）来调节其生物活性. 迄今为止，已发现6种IGFBPs［5，6］，在血液循环系统中主要是以IGFBP3形式存在，分子质量为150 ku，IGFBP2和3在胰腺中有表达［7，8］. 通过研究葡萄糖、外源胰岛素和生长激素对INS1细胞中的IGFBP2基因的表达调控，探索维持胰腺β细胞分泌胰岛素的代谢调节机制.
1材料和方法
1.1材料
牛生长激素（bGH）USAD Reproduction Lab (Beltsville, USA)提供. 重组人胰岛素由Kabi公司惠赠，胰岛素酶标试剂盒从深圳阿尔法公司购置. INS1细胞在完全培养液（CM; RPMI1640, 2 mmol/L Gln, 100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素,1 mmol/L丙酮酸钠,100 ml/L热灭活胎牛血清(heat inactivated fetal calf serum, HIFCS),10 mmol/L HEPES, 50 μmol/L巯基乙醇）中培养. 其余试剂购自Sigma公司.
1.2方法
细胞接种于100 mm培养皿，每板加完全培养液12 mL，（8～9）×106个细胞，生长48～72 h后置于冰上冷却，PBS冲洗1次，用Trizol提取RNA. 将总RNA置于65℃在甲酰胺/甲醛中变性10 min，用10 g/L琼脂糖凝胶（含2.2 mmol/L甲醛）电泳分离，转移至尼龙膜（hybond amersham），紫外交联后与32P标记的cDNA探针于42℃杂交过夜（5×SSPE, 5×Denhardts solution, 1 g/L SDS, 500 g/L甲酰胺），2×SSC冲洗2次（室温），每次15 min，再用捷达801系列扫描密度计进行定量分析. cDNA探针为人IGFBP2 cDNA. 对照组采用IA（来源于雌鼠子宫cDNA文库）和［γ32P］ATP标记的与28S rRNA互补的寡核甘酸. 应用胰岛素酶标试剂盒检测胰岛素： INS1细胞在完全培养液中培养72 h，在10 ml/L胎牛血清和葡萄糖（不同浓度葡萄糖5~20 mmol/L或生长激素）孵育48 h，截止试验结束提取培养液，采用阿尔法公司试剂盒测定胰岛素. 用捷达801系列凝胶分析软件进行密度扫描分析.
统计学处理: 数据以x±s表示，计量资料用SPSS10.0 for Windows进行统计分析，两样本均数比较用t检验（方差齐）或t′检验（方差不齐）；多个样本均数比较，采用方差分析（方差齐性）.
2结果
2.1INS1细胞中IGFBP2 mRNA的表达及调控INS1细胞中存在IGFBP2 mRNA的表达，分子大小1.6 kb. 我们以人乳腺肿瘤细胞作阳性对照(cell line SWS603)，人IGFBP2 cDNA为探针，测定INS1细胞中IGFBP2 mRNA的表达（Fig 1）. INS1细胞置于完全培养液中加入不同浓度的葡萄糖(1～20 mmol/L)，孵育48或72 h，提取总RNA，与IGFBP2 cDNA探针杂交，通过样本均数间的多重比较，结果发现低浓度葡萄糖（葡萄糖浓度为1, 2.8, 5.6 mmol/L ）条件下，IGFBP2 mRNA有表达,3组间无显著差异（P>0.05）. 葡萄糖浓度增至10及20 mmol/L时，与葡萄糖浓度为1, 2.8, 5.6 mmol/L组相比（Fig 2 A,B），IGFBP2 mRNA表达被显著抑制（P<0.05）. 将INS1细胞置于不完全培养液（SFM，去除血清的培养液）中加入1 mg/L bGH（对照组不加）孵育，分别在4, 8, 16, 24和48 h提取培养液进行检测（Fig 3），与对照组相比较,当孵育16 h后，IGFBP2 mRNA表达显著受抑制（P<0.05）. INS1细胞置于完全培养液中,葡萄糖浓度分别为2.8， 5.6和20 mmol/L条件下, 加入1 μg/mL胰岛素（对照组不加）孵育48 h后提取培养液进行检测，与对照组相比较，低浓度（2.8, 5.6 mmol/L）葡萄糖条件下，外源胰岛素抑制IGFBP2的mRNA表达，高浓度（20 mmol/L）葡萄糖条件下，IGFBP2的mRNA未见表达（Fig 4）.
2.2葡萄糖和生长激素对INS1细胞胰岛素分泌的影响INS1细胞置于完全培养液中，分别加入2.8, 5.6, 10和20 mmol/L葡萄糖，培养48或72 h，结果各组有差异（Tab 1）. INS1细胞置于SFM培养液中，葡萄糖浓度为5.6 mmol/L,加入1 mg/L bGH（对照组不加）, 分别培养8, 16, 24和48 h，与对照组相比，胰岛素分泌量出现改变（Tab 2）.表1不同浓度葡萄糖对INS1细胞分泌胰岛素的影响（略） 表2生长激素对INS1细胞中胰岛素分泌的作用（略）
3讨论
IGFs是一类分布广泛的细胞增殖调控因子［9］，通过与细胞表面的受体结合，参与人和脊椎动物多种组织正常生长发育、组织修复、细胞增殖分化. IGFs的生物学活性由IGFBPs调节. 用免疫组化方法研究发现，在成熟的胰岛细胞中存在IGFs及其受体和多种IGFBPs， IGFBP2在胰腺的特异表达说明IGFBP2是β细胞维持正常生理状态的分子标志［7，8］. 我们的实验结果显示，INS1细胞中有IGFBP2 mRNA的表达，其分子大小1.6 kb. INS1细胞是一种较好的研究各种内外因素对β细胞作用的研究模式. 调节胰岛素分泌及β细胞增生的因素包括葡萄糖、氨基酸、生长激素及其相关激素、多肽生长因子、胃肠激素等, 其中GH发挥促生长作用由IGFs介导. 我们的实验结果显示，高浓度葡萄糖和生长激素可以抑制IGFBP2的基因表达，而外源胰岛素也可导致相同结果. 与此同时，前两者还可引起INS1细胞胰岛素分泌量的增加，在INS－1细胞中存在IGFs及其受体，也存在胰岛素和生长激素受体，由此我们推断INS1细胞中胰岛素可能是调节IGFBP2基因表达的直接因子，而葡萄糖和生长激素是通过胰岛素来完成对IGFBP2 mRNA的调控作用，由IGFBP－2对IGFs进行生物学活性的调节. 这为研究胰岛素、生长激素、葡萄糖和IGFs对β细胞增生和功能提供了研究模式. 但IGFBP2在INS1细胞中的作用机制有待于进一步研究.
【】
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