从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂

            作者：李韩平，周宏，郑玉玲，邓小红，马茹，姜永强

【关键词】  葡萄球菌B型肠毒素

    Screening inhibitor of Staphylococcal enterotoxin B from random circular 7mer peptide library displayed on phage

　　【Abstract】  AIM:  To obtain the specific peptide which can bind with SEB and inhibit SEBs enterotoxin activity by panning from the random circular 7mer polypeptide libraries. METHODS:  The affinity of peptide and the competitive activity of the synthetic peptide with that of antiSEB monoclonal antibody (McAb) were detected respectively by PhageELISA and competition ELISA. Animal experiment was performed to assess the suppressive effect of the screened peptide on the toxicity of SEB and its enterotoxin. RESULTS: The circular 7mer peptide obtained by panning suppressed the multiplication of spleen lymphocytes in mice. At the ratio of 160:1 (SEB: synthetic 7mers peptide), the peptide protected the little cats from attack of enterotoxin and the survival rate of mice treated with the screened peptide was significantly higher compared with that of the control group. CONCLUSION:  The obtained peptide specifically combines with SEB and suppresses its enterotoxin activity, which paves the way for the development of SEB inhibitors.

　　【Keywords】  staphylococcal enterotoxin B;  peptide library;  screening;  inhibitor

　　【摘要】  目的： 拟通过生物淘选从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选出与葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)结合并能抑制该毒素毒性效应的特异性短肽. 方法： 采用PhageELISA来鉴定所得目的肽的亲和性；利用竞争ELISA研究合成肽与SEB mAb竞争结合SEB的情况；通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况. 结果： 筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活；合成肽与SEB质量比160∶1下，合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性，并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用. 结论： 得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽.

　　【关键词】   葡萄球菌B型肠毒素；肽库;筛选;抑制剂

　　0引言
　　
　　葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)［1］是超抗原(SAg)家族的主要成员之一，该毒素可以造成食物中毒，严重时甚至导致致死性休克.  SEB中毒后缺乏特异的手段，因此研究SEB的特异高效抑制剂具有重大的意义. 我们利用固相筛选方法，即以SEB作为亲和靶标蛋白，从环状7mer肽噬菌体文库中筛选到与SEB结合，并能抑制该毒素毒性效应的噬菌体克隆. 结果表明，所筛选环状7mer肽在细胞水平上可抑制SEB对小鼠脾细胞的激活，在整体动物水平上对SEB导致的毒性具有一定保护作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　环状7mer肽噬菌体文库( Random circular 7mers peptide library displayed on phage)为New England BioLabsInc产品; M13噬菌体单链DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品； SEB单克隆抗体由本室保存;  DGal(D半乳糖)为Sigma产品；抗M13噬菌体mAb、CM Sepharose FF为Amesham产品; BCA蛋白定量试剂为Pierce产品.乳猫BALB/C实验动物由军事医学院丰台实验中心提供并饲养.

　　1.2方法

　　随机肽库的扩增、定量按照所附试剂盒说明书进行；纯化按QIAprepM13 Handbook进行. 亲和靶标蛋白SEB的分离纯化与定量按［2］方法进行.  依据优势噬菌体阳性克隆序列合成相应的多肽,由军事医学科学院六所合成, 并进行了多肽纯化和脱盐处理,合成多肽的纯度达95%以上. 将纯化的SEB与0.1 mol/L  NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成质量浓度为1 g/ L的溶液,取100 μL混合液加于酶联条微孔进行包板固定，于4℃过夜；次日弃包被液后，加200 μL浓度为 50 g/L BSA于酶联孔中进行封闭，37℃结合2 h,间隙振荡；弃封闭液，取100 mL/L TBST液200 μL洗涤6次,间隔为5 min/次,然后将10 μL肽库原液加于含有100 μL TBST的酶联孔中,室温轻摇过夜;次日弃未结合的噬菌体,取100 ml/L TBST 200μL洗涤10次,间隔为3 min/次,最后加80 μL洗脱缓冲液,室温轻柔吹打10 min后,将洗脱得到的噬菌体转入微量离心管中,立即加入15 μL 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)进行中和. 将所得噬菌体进行感染、扩增、纯化后进行下一轮筛选. 在后续的筛选中TBST的浓度增为500 mL/L. 随机挑取第3轮噬菌体单克隆进行培养后进行PhageELISA分析及DNA序列测定. 将SEB包被酶联板，经30 g/L BSA封闭后加入培养好的单克隆上清，采用PhageELISA法检测SEB与噬菌体的结合情况. ssDNA的提取按照QIAprepM13 Handbook进行，纯化好的ssDNA送往上海博大基因公司进行序列测定.

　　1.2.1活性测定①  采用竞争抑制ELISA考察多肽与SEB的结合情况, SEB包被量为25 μg. 取100 g/L mAb 100 μL,分别与噬菌体单克隆上清200, 100, 50, 25, 0 μL，其中不足200 μL的以8.5 g/L NaCl补齐，然后加兔抗鼠抗体标记的HRP显色，A450 nm比色，观察竞争效果. 结果判断的依据为A值下降，说明多肽抑制了mAb的结合. ②  以鼠脾淋巴细胞为靶细胞，采用噻唑蓝（MTT）法评价合成肽对SEB超抗原的体外抑制活性.
 
　　1.2.2动物实验① 幼猫腹腔接种保护实验： 所用幼猫体质量约为450 g. 将纯化SEB 5 μg溶解于5 mL生理盐水，制成实验对照用液；合成肽与SEB按160∶1质量比进行混合用药. 实验用量为每只4 mL，在5 h内发生呕吐、腹泻者为阳性. 单纯使用SEB的组称为对照组，使用合成肽与SEB的组称为实验组. ② 合成肽对小鼠的保护实验［3］： 实验所用动物为体质量18~22 g的雌性BALB/c小鼠，随机分为4组，每组8只，分别为单纯使用SEB组、使用致敏剂D半乳糖（DGal）组、使用SEB+ DGal+synthetic 7mer peptide组与使用SEB+ DGal组. 合成肽与SEB的比例按照160∶1进行混合用药，SEB用量5 μg/鼠. 致敏剂D半乳糖（DGal）母液浓度为20 mg/鼠.

　　统计学处理： 应用SPSS统计软件，利用单样本t检验对单克隆原种亲和性进行分析, 合成肽对小鼠的保护抑制利用成组设计多样本比较的秩和检验进行分析，以P<0.05为有统计学差异.     2结果
将本室重组表达的蛋白进行CMFF离子交换层析. 纯化产物进行SDSPAGE分析，可获得高纯度的SEB(Fig 1),  为证明噬菌体肽库淘选的有效性，即有富集现象出现，需每轮淘选产量，每次加入噬菌体数固定. 通过3轮淘选发现，随着淘选次数的增加，出现了富集，噬菌体环状7肽肽库第3轮比第一轮的产量高出1.375倍.  经过3轮亲和筛选，随机挑选14个分隔良好的单克隆制备原种，进行PhageELISA鉴定，以高出阴性对照5倍的单克隆作为阳性克隆,结果如Fig 2，其中15为阴性对照. 对噬菌体单克隆原种A450进行单样本t检验，t0.05/2（13）=2.160＜t=10.85, P＜0.05，相对于阴性对照A450，噬菌体单克隆原种A450具有显著性差异. 从以上结果可以看出，经过3轮筛选噬菌体得到了明显富集，可见亲和筛选的方法是有效的，已得到与SEB特异结合的短肽. 选取10个阳性克隆进行测序 ，推导出相应的氨基酸序列. 即为噬菌体外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合展示的环状7肽. 通过筛选得到的阳性克隆序列具有很好的一致性，均为CLPRQSSFC. 

 　　2结果

                                   
　　2.1合成肽对SEB超抗原作用的体外抑制活性合成多肽的纯度达实验要求，质谱分析测定的分子量与理论值相符，说明合成的多肽结构正确，合乎测试要求，可用于生物学活性的检测和评定. 将与SEB高亲和力的噬菌体单克隆原种培养上清做系列稀释，与SEB单抗进行竞争抑制ELISA实验，结果在一定稀释梯度内竞争抑制呈线性上升(Fig 3). 这说明筛选所得短肽与SEB结合位点与SEB mAb结合位点一致. 以鼠脾淋巴细胞为效应细胞，MTT法测试，SEB在低浓度下，合成的短肽抑制效果较为明显，随着SEB浓度的递增，这种抑制作用逐渐减弱（Fig 4）.

　　2.2动物实验结果幼猫腹腔接种后1 h左右，对照组出现呕吐、腹泻、精神萎靡、行走困难症状；18 h后，幼猫开始饮水进食，并恢复好动习性；而实验组则无上述症状的出现. 显示，合成肽可以保护幼猫免受SEB肠毒毒性攻击，证明筛选所得环状7肽有效. 为进一步证明肽的有效性，将合成的肽与SEB混合进行动物实验. 结果如Fig 5，秩和检验χ2=18.459, P＜0.05,可认为利用肽进行保护组存活率优于单纯使用DGal+SEB组，在用药后的10 h内，这种保护作用尤为明显，随着用药时间的延长，保护作用逐渐减弱. 结果证明，筛选所得肽在一定时间范围内对SEB具有明显的抑制作用.

　　3讨论

　　肽库技术是引入组合策略和模拟进化思想，建立起的一种筛选药物先导化合物的新方法. 从噬菌体表位随机肽库中筛选药物先导化合物，可以快速筛选生物活性肽，这一方法具有传统的药物筛选方法无法比拟的优越性［4］.
 
　　PhageELISA检测结果显示，单克隆原种多数A450 nm比阴性对照高出9~10倍，而一般认为高出阴性对照5倍即为阳性，且筛选得到的单克隆序列具有很好的一致性，因此以固相的SEB进行亲和筛选是成功的，这也与报道相符［5,6］. 利用SEB单抗进行竞争抑制，在一定浓度范围内，抑制效率基本呈线性关系，这就说明筛选得到的短肽与SEB的结合位点和单克隆抗体与SEB的结合位点重叠. 已有实验证明，SEB可促进脾淋巴细胞增殖［7］，而在本实验中，SEB的超抗原活性体外实验证明，在一定浓度范围内合成肽可以抑制脾淋巴细胞的增殖，这就间接证明合成肽对SEB具有较好的抑制作用,这也与文献报道相一致［8］. 幼猫腹腔实验显示，合成肽对SEB的肠毒活性有较强的抑制作用. 小鼠的致死实验表明，合成肽可以延缓小鼠死亡时间，表现出一定保护作用. 在用药的10 h内，保护组小鼠没有出现死亡，而实验组存活率仅为25%，但随着时间的延长，保护作用的减弱估计与合成短肽半衰期短，在体内不稳定，易受体内环境影响发生降解有关.

　　【文献】

　　［1］ 雷祚荣著. 葡萄球菌和葡萄球菌素病［M］. 北京： 技术出版社,1992: 1992.

　　［2］ 姜永强，宁保安，郑玉玲,等. 重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2002; 18(4): 323-326.

　　Jiang YQ, Ning BA, Zheng YL, et al. Preparation and antitumor activity analysis of recominant SEB ［J］. Chin J Cell Mol Immunol, 2002;18(4):.323-326.

　　［3］ Miethke T, Wahl C, Heeg K, et al. T cellmediated lethal shock triggered in mice by the superantigen staphylococcal enterontoxin B: critical role of tumor necrosis factor ［J］. Exp Med, 1992;175:91-98.

　　［4］ 秦鑫，赵宁，张英起，等. 人转铁蛋白受体结合肽的噬菌体肽库筛选与鉴定［J］. 第四军医大学学报, 2004; 25（12）：1117-1119.

　　Qin X, Zhao N, Zhang YQ, et al. Isolation and identification of a novel peptide binding to human transferrin receptor from phage display library ［J］. Fourth Mil Med Univ, 2004;25（12）：1117-1119.

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　　［6］ Wang G, De J, Schoeniger JS, et al.  A hexamer peptide ligand that binds selectively to staphylococcal enterotoxin B: Isolation from a solid phase combinatiorial library ［J］. Pept Res, 2004; 64(2):51-64.

　　［7］ 陈钰，彭虹，尉承泽，等. 超抗原SEB在同种异体细胞移植小鼠中诱导的免疫耐受及其特征［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2002;18(2):101-103.

　　Chen Yu, Peng H. Immunotolerance and its characteristics induced by SEB in mice receiving allogenic cell transplantation ［J］. Chin J Cell Mol Immunol, 2002; 18(2):101-103.

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