剥夺异相睡眠导致大鼠海马中神经元性一氧化氮合酶阳性细胞表达减少与记忆维持

          作者：张福康，侯一平，宋焱峰，刘向文，王德贵

Changes of nNOS positive neurons in hippocampus and memory consolidation after paradoxical sleep deprivation in rats

　　【Abstract】 AIM: To study the changes of memory processes and consolidation during paradoxical sleep in rats and to observe the alteration of neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity (nNOSIR) neurons in hippocampus after paradoxical sleep deprivation. METHODS:  Aradoxical sleep deprivation was performed using the "lower pot technique" The control groups (CC), tank control groups（TC） and paradoxical sleep deprivation groups（PSD） were tested in Morris Water Maze. At the end of the experiment, the animals were sacrificed under chloral hydrate anesthesia (0.4 g/kg) by intraaortic perfusion of a fixative solution. Coronal sections were cut at 25 μm thickness on a freezing microtome and up to five series of adjacent sections were collected for nNOS immunohistochemical processing using streptavidinbiotinperoxidase complex technique (SABC technique). RESULTS:  The memory consolidation in PSD 24 h, PSD 48 h and PSD 72 h rats declined significantly compared with that in TC 24, 48, 72 h as well as CC 24, 48, 72 h rats (P<0.05), indicating that PSD caused a significant impairment in reference memory. The nNOSexpressing cells in hippocampus of PSD 24, 48, 72 h rats were significantly fewer than those in TC 24, 48, 72 h as well as CC 24, 48, 72 h rats (P<0.05). CONCLUSION: ①Paradoxical sleep deprivation may cause a disturbance of memory processes and consolidation and paradoxical sleep is associated with memory. ②The nNOSIR neurons in hippocampus formation decrease in PSD groups compared with those in CC and TC groups. nNOS in hippocampus may play a key role during paradoxical sleep and spatial memory.

　　【Keywords】 sleep; learning & memory; hippocampus;rat; nNOS

　　【摘要】 目的:  揭示记忆是否在异相睡眠中得到加强和巩固，取消异相睡眠是否导致记忆维持能力下降及其下降的机制. 神经元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）是否参与记忆中枢海马结构调节，剥夺异相睡眠（paradoxical sleep deprivation，PSD)是否改变它们在海马的表达. 方法: ①采用小平台法建立PSD大鼠动物模型. 应用Morris水迷宫测试系统检测大鼠空间记忆获得及维持的变化; ②海马的nNOS免疫组化研究：PSD 24，48和72 h后，立即取脑、固定、行冰冻切片（片厚25 μm）、SABC法免疫组化染色、光镜下进行观察分析、摄像. 结果：①PSD可造成大鼠空间参考记忆维持能力的损伤； ②PSD组大鼠海马中nNOS免疫反应阳性细胞在CA1，CA2，CA3，CA4及锥体细胞层、颗粒层、齿状回稀疏，数目较相应的大平台组（tank control groups, TC group）、正常饲养组（control groups, CC group）明显减少(P<0.05). 而TC组与CC组相比较无明显变化. 结论： ① PSD可以造成大鼠空间记忆的巩固障碍，异相睡眠与空间记忆维持有关； ② PSD可以造成海马nNOS阳性细胞的表达减少，海马中的nNOS可能参与了大鼠空间记忆巩固的过程.

　　【关键词】 睡眠；记忆；海马；大鼠； 神经元性一氧化氮合酶

　　0引言

　　近年来人们对睡眠和学习记忆之间的关系进行了广泛的研究，尤其是异相睡眠与学习记忆的关系是近年来神经研究的热点问题. 以往大量研究集中在异相睡眠与记忆获得的机制上，而异相睡眠与记忆维持的关系所见报道不多. 我们通过Morris水迷宫建立空间记忆获得模型，用小平台技术（flower pot technique）建立异相睡眠剥夺（paradoxical sleep deprivation，PSD)模型［1］. 应用空间记忆获得后PSD的方法，观察PSD后大鼠的记忆维持能力的改变，及其神经元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS)在学习记忆中枢海马表达的变化. 旨在探讨异相睡眠与记忆维持的关系及其可能机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康雄性Wistar大鼠45只，体质量（308±20）g ，由甘肃省医学科学院提供. 连续学习训练4 d结束后，立即用随机数字表法将所有大鼠随机分为3组(24 h组, 48 h组和72 h组),每组15只. 每组再分为：PSD组，大平台（tank control groups, TC）组；正常饲养组（control groups, CC group）. 每小组5只. nNOS多克隆抗体（Ab1参考效价1∶200），SABC试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS缓冲液等均购自武汉博士德公司.

　　1.2方法

　　1.2.1Morris水迷宫空间记忆动物模型的建立①水迷宫的组成：一直径为150 cm的圆形水池，直径10 cm、高15 cm的平台，以及水迷宫测试系统. 为了增强迷宫与大鼠的色彩对比，水池内壁及平台均漆成黑色. 实验时，平台隐藏在水下（低于水面2 cm），水温保持在（20±2）℃. 水迷宫测试系统购自北京Genheart公司，由数码摄录机、A/D转换卡及与其相连的机、相关软件等组成; ②PSD箱的制作：大小30 cm×30 cm×30 cm ，中央放置一直径为6.5 cm，高8 cm的平台. 剥夺箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在（20±2）℃左右. 大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入异相睡眠时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，造成PSD. TC组与PSD组的环境相同，只是平台直径为20 cm. CC组饲养在干燥鼠笼内； ③水迷宫空间学习记忆的训练：训练开始前，大鼠单个饲养以适应实验室环境1 wk. 每日逐一给予适当抓摸以消除其恐惧感. 训练在每日8:00～13:00间进行. 预先将迷宫任意分为4个象限. 平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中（在训练的4 d中位置一直保持不变），测量水温和水面距平台的高度达到实验要求后，于池边任意取一入水点，大鼠面向池壁入水，计算机自动跟踪计时. 允许在120 s内找到平台，找到后在平台上保持15 s. 若在120 s内找不到，则将大鼠引导到平台上并保持15 s. 每只大鼠在同一入水点连续训练2次，以第1次训练（trial 1）成绩衡量空间记忆的获得水平，第2次（trial 2）成绩衡量空间工作记忆水平. 全部动物按照上述方法完成第1个入水点的训练后继续进行第2、第3及第4个入水点的训练. 每次训练结束后擦干大鼠身体，放入各自的鼠笼内并适当给予保暖. 连续4 d训练期间，迷宫周围的参照物（包括灯光、周围的器物等）必须保持不变. 其中所有的PSD组、CC组及TC组在4 d训练结束后立即分别放入睡眠剥夺箱、大平台水箱和普通鼠笼,室温控制在（22±2）℃，避免噪音，保持24 h光暗周期，每日7:00～19:00开灯照明. 24，48和72 h后，分别将24, 48和72 h组大鼠再次任意选取两个入水点，每个点连续两次寻找平台，其结果用来衡量记忆的变化. 此时水下平台所处的位置与训练时相同.

　　1.2.2主要观察指标①大鼠在迷宫中的游泳轨迹（track）；②潜伏期（latency, L）,大鼠从入水到找到平台的时间；③距离(distance, D)，大鼠从入水到找到平台的游泳距离；④速度(velocity, V)；⑤平台所在象限轨迹（时间）的分布(percentage of track or time in correct quarter, PQ)；⑥记忆得分(memory score, MS).

　　1.2.3nNOS免疫组化取脑连续冠状冰冻切片（LEICA RM2135），片厚25 μm,切片入0.1 mol/L PBS液中，隔5取1捞片，4℃冰箱保存备用. 共4套分别采用SABC（streptavidinBiotinperoxidaseComplex）法进行nNOS的免疫组化染色. nNOS阳性细胞胞质呈棕黄色. 每片随机选取5个高倍视野，记数阳性细胞数.

　　统计学处理：所有数据以x±s表示，连续4 d各点第1, 2次探索距离、记忆得分采用重复测量方差分析，其余数据采用单因素方差分析，均数两两比较行LSDt检验，方差不齐各组间的比较采用非参数检验，P<0.05为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的测试随着训练次数的增加，大鼠空间学习记忆能力逐渐增强,连续4 d各点第1，2次探索距离、记忆得分有差异（Tab 1）；PSD 24，48和72 h后各入水点搜索平台的结果也有差异（Tab 2）.表1连续4 d各点第1，2次探索距离、记忆得分的结果（略）表2剥夺异相睡眠24，48和72 h后探索距离、记忆得分的结果（略）

　　2.2海马的nNOS免疫组化nNOS阳性细胞均为神经元，胞质和突起浓染，大部分集中于锥体细胞层和颗粒细胞层内或边缘，胞体多为锥形或梭形 .  PSD组大鼠海马各亚区及齿状回阳性细胞分布稀疏，数目较TC和CC组明显减少(P<0.05). 而TC组与CC组相比较无明显变化(Tab 3, Fig 1).表3PSD组大鼠海马各亚区及齿状回阳性细胞分布（略）

　　3讨论

　　Morris水迷宫是英国心家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制的研究［2］. 此后，该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中，实验动物主要是大鼠［2］.

　　我们Youngblood等［3］的设计方法，用每个入水点的第一次训练成绩来衡量空间参考记忆的获得和保持水平，用第二次训练成绩来衡量空间工作记A: TC; B: PSD 24 h; C: PSD 48 h; D: PSD 72 h.

　　忆的水平. 大鼠的每个入水点第一次探索时，由于时间和空间的改变，不能与上一次探索之间形成顺序性关系，大鼠只能依照环境的参照来确定水下平台的位置. 其记忆属性为参考记忆. 大鼠的每个入水点第二次探索时，与第一次探索在空间和时间上都存在连续性，大鼠可以根据刚刚获得的信息找到水下平台，其记忆属性为工作记忆.

　　实验结果发现，全部大鼠通过训练后建立了不同程度的空间记忆. 从PSD组大鼠在同一时段其第一次探索游泳潜伏期、距离均大于其相应的TC组和CC组，记忆得分（MS）小于TC，CC组大鼠，其差异有显著性（P<0.05）. 由于Morris水迷宫各个不同入水点的第一次成绩反映空间参考记忆的获得和维持水平，说明PSD可造成大鼠空间参考记忆获得和维持能力的损伤. TC，CC组大鼠之间其参数统计没有明显差异，说明水环境对学习记忆的影响不大. 但Youngblood等［3］认为，水环境的应激可以造成大鼠出现窘迫状态，从而导致学习记忆能力下降. 宋国平等［4］认为，水环境应激可以促使肾上腺素、乙酰胆硷、血管紧张素的释放，提高中枢神经系统的兴奋性，提高学习记忆的能力. 在实验中，我们发现PSD组大鼠从PSD开始后出现自主活动明显增多，对外界刺激敏感，易激惹. TC组与PSD组同处于水环境中，虽然也出现自主活动增多，但程度轻. 上述结果表明，PSD和TC组大鼠都对水环境有应激反应，但程度不同. 而实验中除了平台大小不同外，两组的其他条件相同. 有大量研究表明，海马与学习记忆密切相关. 海马直接参与信息的储存后回忆，与长期记忆的形成有关， 因此，PSD组学习记忆能力的下降主要是PSD所至.

　　nNOS调节中枢神经系统中的NO的释放，长时程增强（long term potentiation, LTP)的表达与NO的产生呈现正相关［4］. Vincent等［5］在研究中发现，NO可以调节Ach的释放，NO释放增多，Ach分泌也增多. 应用NOS抑制剂灌注脑组织可以使Ach基础释放量减少40%，而Ach与学习记忆及睡眠的周期密切相关. 另外，NO还参与突触重塑的调节，NO的减少可使突触重塑能力下降. LTP是神经可塑性和突触传递的一种表现形式，被认为是学习记忆的细胞学基础. 而突触重塑是LTP的基础［4,6］.
  
　　实验中发现，PSD后PSD组与TC，CC组相比较，PSD组大鼠海马中nNOS阳性神经元表达稀少，数量明显低于TC和CC组. 因而可以推测：PSD可以造成海马nNOS的表达减少，从而导致NO的产生减少，这可能是导致PSD造成大鼠空间学习记忆能力下降的原因之一.

　　【参考】

　　［1］ Mendelson WB, Guthrie RD， Frederick G, et al. The flower pot technique of rapid eye movement (REM) sleep deprivation ［J］. Pharmacol Biochem Behav, 1974; 2（2）:553-556.

　　［2］ Morris RGM, Garrud P, Rawlins JNP, et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions［J］. Nature, 1982;297:681.

　　［3］ Youngblood BD， Smagin GN, Elins PD, et al. The effects of paradoxical sleep deprivation and valine on spatial learning and brain 5HT metabolism ［J］. Physiol Behav, 1999; 67(5): 643-649.

　　［4］ 宋国平，苗丹民，皇甫恩，等. 睡眠剥夺对大鼠学习和行为的影响［J］. 第四军医大学学报，2000；21（6）：663-666.

　　Song GP, Miao DM, Huangfu E, et al . Effects of sleep deprivation on rats behavior and learning ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2000;21(6):663-666

　［5］ Vincent SR, Williams JA, Reiner PB, et al. Monitoring neuronal NO release in vivo in cerebellum, thalamus and hippocampus［J］. Prog Brain Res, 1998;118:27-35.

　［6］ 王德贵，宋焱峰，张维胜,等. 剥夺异相睡眠对大鼠海马结构突触囊泡膜蛋白表达的影响［J］. 第四军医大学学报，2004；25（2）：111-113.