pTracer/mIFN

            作者：张晓智，陈葳，李旭，徐海伟

【关键词】  绿色荧光蛋白

    Study on biological properties of mouse embryonic stem cells modified by pTracer/mIFNγ

　　【Abstract】 AIM: To study the characteristics of embryonic stem (ES) cells transfected with pTracer/mIFNγ. METHODS:  The gene pTracer/mIFNγ including IFNγand green fluorescent protein (GFP) was transfected to obtain ES/ pTracer/mIFNγ cells by electroporation. RTPCR and ELISA were used to detect IFNγ expression at transcription and protein level respectively and green fluorescence was detected with fluorescence microscope to prove the GFP expression. Colony formation rates for ES/pTracer/mIFNγ cells and ES cell were conducted respectively. ES/pTracer/mIFNγ cells were induced to differentiate into neural precursor cells (NPCs) in serumfree selective medium and nestin immunoreactive was identified by immunocytochemistry. RESULTS:  Green fluorescence was observed in ES/pTracer/mIFNγ cells and IFNγ concentration was (44.25±12.23)μg/L 72 h after gene transfection. ES/pTracer/mIFNγ cells were positive to alkaline phosphatase. The cell colony formation rates of ES cells and ES/pTracer/mIFNγ cells were 73.66% and 70.89%, respectively (P>0.05). ES/pTracer/mIFNγ cells differentiated into NPCs, which had potency to differentiate into all kinds of neural cells. CONCLUSION:  The cells modified with IFNγgene may not influence the proliferation, differentiation and the pluripotentiality of ES cells.

　　【Keywords】 interferonγ; green fluorescent protein; embryonic stem cells; biological characteristics

　　【摘要】 目的: 探讨IFNγ基因转染对小鼠ES细胞生物特性的影响. 方法: 电穿孔法将pTracer/mIFNγ共表达载体转入小鼠ES细胞，荧光倒置显微镜下观测绿色荧光，RTPCR, ELISA检测转基因ES细胞IFNγ表达. 碱性磷酸酶染色，测定ES/pTracer/mIFNγ和ES细胞的细胞克隆形成率；无血清培养法诱导ES/pTracer/mIFNγ细胞定向分化为神经前体细胞（NPCs），免疫组化法检测nestin表达. 结果: 转染共表达载体pTracer/mIFNγ的ES/pTracer/mIFNγ细胞发绿色荧光，有IFNγ表达，转染72 h后的细胞培养液中IFNγ量为(44.25±12.23) μg/L；ES细胞和ES/PTracer/mIFNγ细胞的集落形成率分别为73.66%和70.89%，差异无显著性. ES/pTracer/mIFNγ细胞经诱导可分化为nestin阳性NPCs. 结论: IFNγ基因转染对ES细胞的未分化特性、增殖能力及向神经系统分化潜能无明显影响.

　　【关键词】 干扰素γ；绿色荧光蛋白；胚胎干细胞；生物学特性

　　0引言

　　绿色荧光蛋白（green fluoscent protein，GFP）是一种在紫外光激发后能直接发出绿色荧光的蛋白质，可在异源生物中表达且无细胞毒性. GFP作为报告基因不仅可用于靶蛋白定位和功能观察，并可示踪表达GFP的细胞在动物体内的分布［1］，GFP基因整合和表达对胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）的生物学特性没有影响［2，3］. INFγ是由T细胞分泌的多功能的调节因子，早在10 a前就有利用ES细胞对IFNα和IFNβ的反应研究发育调控基因的报道［4］. 最近研究发现，IFNγ可通过直接细胞毒作用抑制胚胎生长［5］. 目前尚未见到INFγ基因转染对ES细胞生物学特性影响的报道.

　　我们用含GFP和IFNγ的共表达载体pTracer/mIFNγ转染ES细胞并鉴定，采用无血清培养法体外诱导ES/pTracer/mIFNγ细胞获得神经前体细胞（neural precursor cell, NPC），探讨pTracer/mIFNγ基因修饰对ES细胞增殖、分化能力等生物学特性的影响，为应用ES细胞进行的基因提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　ES细胞株MESPU13由北京大学生命部提供. 含GFP和IFNγ的共表达载体pTracer/mIFNγ由科学院协和徐兴祥博士提供. DMEM/F12培养基及N2 supplement 购自Gibco公司. 多聚鸟氨酸及纤维连接蛋白购自Sigma公司. SABC试剂盒和nestin抗体购自武汉博士德公司. 质粒提取试剂盒购自Boehringer Mannheim公司. 小鼠IFNγ ELISA检测试剂盒（Endogen公司）. DNA Marker（华美公司）. 其他试剂为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1pTracer/mIFNγ转染ES细胞及鉴定ES细胞培养于ES细胞培养液中［6］，采用电穿孔法［7］将GFP和IFNγ共表达载体转入ES细胞，荧光显微镜下挑取可稳定表达GFP的阳性克隆培养，RTPCR检测mIFNγ表达，ELISA法检测培养液中mIFNγ含量.

　　1.2.2ES/pTracer/mIFNγ细胞碱性磷酸酶染色方法见［6］.

　　1.2.3ES/pTracer/mIFNγ细胞集落形成率测定取ES/pTracer/mIFNγ细胞，用滴管吹打数次细胞悬液，尽量将细胞集落吹散，然后将细胞悬液作梯度倍数稀释，按每皿50，100个细胞或小集落的密度，接种于含2 mL条件培养液的35 mm培养皿中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀. 置CO2孵箱内37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度下培养，第3日将培养皿放置在一张带网格的透明胶片上，在倒置显微镜下计数细胞集落数，ES细胞作对照. 用下列公式集落形成率：集落形成率(％)= 集落数/接种细胞数×100％.

　　1.2.4体外诱导分化获得NPC及鉴定ES/pTracer/mIFNγ细胞胰酶/EDTA消化，吹打成单细胞悬液，以1.5×108/L的细胞密度加入细菌培养皿中，于含150 mL/L胎牛血清（FCS），100 μmol/L β巯基乙醇的DMEM培养基中，37℃，50 mL/L CO2培养. 将第4日的胚胎体转入经多聚鸟氨酸和纤维连接蛋白预处理的6孔板中，在DMEM100 mL/L FCS培养基中培养24 h使其贴壁， N2培养基培养，每2 d换液1次. 免疫组化法测定培养细胞的nestin表达.

　　统计学处理：应用统计软件SPSS 10.0行t检验.

　　2结果

　　2.1ES/pTracer/mIFNγ细胞的鉴定GFP表达：在pTracer/mIFNγ转染的ES细胞集落中，倒置荧光显微镜下可见强度不等的绿色荧光，提示有GFP蛋白表达. pTracer/mIFNγ转染ES细胞后24，48和72 h有逐渐增多的发绿色荧光的细胞，转染效率分别为（10.8±2.7）%，（41.7±3.0）%和（80.5±3.9）% (n=6). IFNγ mRNA表达：ES/pTracer/mIFNγ细胞总RNA的A260 nm/280 nm=2.0927，浓度为159 mg/L. RNA电泳观察可见28S，18S二条带，表明RNA无明显降解，RNA样品无明显基因组DNA污染. RTPCR扩增后在转染细胞可见IFNγ特异性基因扩增条带，大小为492 bp（Fig 1），表明IFNγ基因已转入细胞并表达. IFNγ测定： ES/pTracer/mIFNγ细胞培养上清可检测到IFNγ，24 h为(5.64±2.16) μg/L，48 h为(20.54±11.42)μg/L，72 h达(44.25±12.23)μg/L. 转染后14 d培养上清中仍可检测到IFNγ，浓度为(31.22±8.64)μg/L，提示mIFNγ基因已成功地转入ES细胞并表达.

　　2.2pTracer/mIFNγ转染对ES细胞生物学特性的影响碱性磷酸酶染色：稳定表达GFP和IFNγ的ES/pTracer/mIFNγ细胞集落NBT/BCIP染色后，呈紫蓝色椭圆形，集落周边清楚，细胞细小，排列紧密，界限清楚，背景的饲养层细胞不着色（Fig 2）. ES细胞集落形成率：培养的ES/pTracer/mIFNγ细胞和未转基因ES细胞集落形成率分别为（70.89±1.67）％和（73.66±2.12）％(n=10)，差异无显著性，提示该基因转染对ES细胞增殖无明显影响. 体外诱导ES/pTracer/mIFNγ细胞获得NPC：去除饲养层和LIF，ES/pTracer/mIFNγ细胞在含β巯基乙醇的DMEM100 mL/L的细菌培养皿中培养至第4日，细胞体积增大，形成由上百个细胞组成的胚胎体（Fig 3）. 胚胎体贴壁后，周围细胞为单层上皮样形态，中心部位为多层细胞. 更换成无血清选择性培养基ITSF或N2后培养24 h，多层细胞覆盖的部位大多变为单层，贴壁细胞形态无变化. 48 h后，细胞大量死亡，从底壁脱落，贴壁细胞形态发生变化，大部分细胞为上皮样，72 h后仍有死细胞漂浮，存活的细胞形态多数为细长形，无上皮样形态的细胞存在. 取第5日的细胞作nestin免疫细胞化学染色，约85%的细胞为nestin阳性的NPC（Fig 4），与对照组ES细胞基本相同.

　　3讨论

　　电穿孔法基因转染是将DNA和靶细胞放入低传导液的电极槽中通电，通过打孔和细胞的胞饮作用，使基因穿过细胞膜转入细胞中，并得到表达. 这种方法不依赖细胞的特性，可用于几乎所有类型的细胞. ES细胞分裂增殖很快，易受外界因素影响，进行基因操作应尽可能在短时间内完成. 电穿孔法相对简单快速，转染效率较化学法高，目前报道的ES细胞基因转染多用此法［8］. 我们将pTracer/mIFNγ导入ES细胞，转染后得到高效表达.

　　GFP是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质，相对分子质量(Mr)为27 000，有238个氨基酸，在原核和真核生物中均可表达. 它在异源细胞内融合表达后环化成熟，自发产生荧光且对异源细胞的生理过程无干扰，因而可应用于活体细胞的实时监测，是一个非常理想的报告基因. 本研究所用的含GFP和IFNγ的pTracer/mIFNγ共表达载体中含有一个SV40早期启动子，同时亦含有CMV早期即刻启动子，可有效促进插入目的基因（mIFNγ）的表达. GFP以非融合蛋白的形式表达，不影响mIFNγ的表达及完整性. GFP基因的表达给我们在细胞转染过程中鉴定和转挑选阳性细胞克隆、检测转染效率等带来了方便，同一细胞克隆在可见光和荧光显微镜下对照观察就可知转染结果. 实验结果提示，pTracer/mIFNγ在ES细胞中有较高效率的表达，在荧光显微镜下可见发绿色荧光的ES细胞，进一步用ELISA法检测到mIFNγ，证明GFP并未影响mIFNγ的表达.
采用基因工程技术，可以根据不同目的，对ES细胞进行遗传学修饰，制成基因工程细胞. 此时外源基因的整合和表达对ES细胞生物学特性影响就成为决定其能否有效发挥和修复作用的关键因素.

　　IFNγ对肿瘤细胞有直接抑制作用，并可诱导瘤细胞凋亡和分化. ES细胞和肿瘤细胞相似的是，二者都是分裂增殖较快的细胞，IFNγ是否也对ES细胞有作用呢？Zou等［5］应用ES细胞研究外源性IFNγ对胚胎的毒性及机制，发现IFNγ在5×105 U/L以上时ES细胞活力降低，1×105 U/L时则对ES细胞没有影响. 进一步发现［9］IFNγ对ES细胞生长的影响是通过凋亡来实现的，呈剂量依赖性. IFNγ基因转染对ES细胞的生物学特性有无影响尚未见报道. 我们将pTracer/mIFNγ转入ES细胞后，碱性磷酸酶染色表明，表达IFNγ基因的ES细胞同未转基因的ES细胞一样，保持未分化状态；细胞集落形成实验提示IFNγ基因转染对ES细胞增殖分裂能力无影响. ES/pTracer/mIFNγ细胞经诱导可分化为NPC，该细胞具有向神经系统各个细胞系分化的潜能. 依据以上结果，可推断转染IFNγ基因的表达对ES细胞主要生物学特征没有明显影响，但是，IFNγ基因的长期作用的后果尚需进一步积累研究资料.

　　将目的基因转入ES细胞是利用ES细胞进行基因治疗或研究的关键步骤. 本研究不但获得了ES/pTracer/mIFNγ细胞，也证明了转染IFNγ基因对ES细胞的主要生物学性状无影响，为ES/pTracer/mIFNγ细胞用于肿瘤治疗提供了实验依据.

　　【】

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