FHIT基因转染对肝癌细胞系HepG2的作用

【关键词】  肝癌

    Role of transfection of FHIT gene in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

　　【Abstract】 AIM: To study the role of transfection of FHIT gene into a human liver cancer cell line HepG2. METHODS:  FHIT gene was transfected into human liver cancer cell line HepG2 by lipofectamine. After selection with G418, resistant colonies were obtained. The overexpression of FHIT was detected by immunochemistry and Western blotting methods. Apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry (FCM). The morphological changes were observed by light and electron microscope. RESULTS:  Stable expression of FHIT protein in transfected HepG2 cells was obtained and the growth rate of these transfected HepG2 was inhibited. Early apoptosis was observed under transmission electron microscope and flow cytometry showed that the progression of cell cycle was arrested from S phase to G2 phase. CONCLUSION:  The results indicate that FHIT gene can inhibit the growth and proliferation of HepG2 by inducing its apoptosis and cell cycle arrest in vitro.

　　【Keywords】 FHIT； gene transfer； apoptosis; hepatocarcinoma

　　【摘要】 目的：探讨外源性FHIT基因的表达对肝癌细胞株HepG2的影响. 方法：用脂质体介导法将pcDNA3.1FHIT及空载体pcDNA3.1(+)导入肝癌细胞系HepG2中，G418选择培养，经免疫组化和Western blotting鉴定其过表达. 用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察FHIT基因的表达对HepG2细胞凋亡和增殖的影响. 结果：获得FHIT基因稳定表达的肝癌细胞株HepG2FHIT. 转染FHIT基因的HepG2细胞的生长速率明显下降,电镜下超微结构发生了凋亡早期改变，流式分析细胞的生长周期可见S／G2期阻滞. 结论：外源性FHIT基因在体外通过诱导其凋亡及细胞周期俘获作用可有效抑制HepG2生长增殖.

　　【关键词】 FHIT基因; 基因转染；凋亡；肝癌

　　0引言

　　脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad, FHIT）基因是一个新的抑癌基因，在多种肿瘤中存在转录异常和表达缺失. FHIT基因对细胞生长的调控和凋亡的诱导不同于经典的抑癌基因，FHIT基因只出现纯合子或半合子的缺失，只有少数肿瘤中可检测到点突变，但其具体的抑癌机制还不是很清楚. 我们将FHIT基因的真核表达载体pcDNA3.1FHIT转染至人肝癌细胞系HepG2中，并得到稳定的过表达，从细胞形态学和细胞周期方面探讨FHIT基因对肝癌HepG2细胞的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　质粒pcDNA3.1FHIT由本室构建，大肠杆菌DH5α由第四军医大学生化教研室李云峰硕士惠赠，HepG2由本校病理教研室严小昱硕士惠赠；小量质粒提取试剂盒购自Omega公司； FHIT兔抗人多克隆抗体、二抗购自北京中山公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，其他生化试剂分析纯.

　　1.2方法

　　参照杨安钢等［1］所述，制备感受态大肠杆菌DH5α，质粒pcDNA3.1FHIT转化细菌后进行扩菌,按Omega公司小量质粒提取试剂盒说明提取、纯化质粒DNA，用分光光度计测定纯度及浓度. 同时取1 mL菌种送交上海鼎安公司测序. 设置pcDNA3.1FHIT转染组、未转染对照组、pcDNA3.1(+)转染组，按照Lipofectamine 2000说明书分别进行转染HepG2细胞，接种于含G418（800 mg/L）的选择性培养液中，培养4 wk后细胞克隆化. 将3组细胞接种于盖玻片上，常规培养细胞，运用细胞免疫组化检测转染FHIT蛋白的表达. 经免疫组化染色呈阳性的转染后的细胞，扩大培养，提取总蛋白，进行蛋白定量和Western blotting印迹分析.

　　1.2.1细胞形态学观察在约0.5 cm×0.5 cm大小的玻片上种1000个细胞，在DMEM培养液中，CO2孵箱，37℃培养，当细胞处于对数生长期的时候收获细胞. 将细胞爬片用10 mmol/L PBS洗2 min×2，丙酮固定20 min. 10 mmol/L PBS洗4 min×2，作细胞爬片HE染色. 取对数生长期的3组细胞，接种于100 mL培养瓶中. 待细胞铺满瓶底的80%时，胰蛋白酶消化，10 mmol/L PBS洗涤，收集细胞于Ep管内，40 g/L戊二醛4℃固定过夜，包埋时用10 mmol/L PBS洗3次，每次10 min. 10 g/L锇酸固定4℃,1 h，系列丙酮脱水，Epon812树脂包埋，修块，制备超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜观察并照相.

　　1.2.2细胞生长特性分析取对数生长期的pcDNA3.1FHIT转染组、pcDNA3.1(+)空载体转染组细胞及未转染对照组，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液. 分别接种于24孔培养板，1×104细胞/孔. 从接种2 d起，每24 h用胰蛋白酶消化细胞，用血细胞计数板计数，每个孔计3次，每个时间点每种细胞设4个平行孔，取其平均值. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞的生长曲线. 取对数生长期的3组细胞，接种于100 mL培养瓶中. 待细胞80%铺满时，用2.5 g/L胰蛋白酶0.2 g/L EDTA液消化，使细胞成为单细胞悬液，10 mmol/L PBS洗3次，收集细胞加入4℃预冷的700 mL/L乙醇10 mmol/L PBS，吹打均匀，4℃固定2 h以上. 10 mmol/L PBS洗涤1次，用含10 mL/L Triton X100， 0.1 g/L Rnase酶处理细胞30 min. 5 g/L碘化丙（Propidium Iodide，PI）4℃，20 min，过300目尼龙网. 上流式细胞仪测定在488 nm波长下DNA含量，用Multicycle软件分析细胞周期分布.

　　2结果

　　转化、扩增、提取及纯化的质粒pcDNA3.1FHIT，经测序证实FHIT序列与GenBank数据库所收录的FHIT序列完全一致. pcDNA3.1FHIT转染组的HepG2细胞在胞质中可见棕黄色染色，pcDNA3.1(+)转染组和未转染对照组的HepG2细胞未见明显染色，提示FHIT蛋白表达于细胞质中（Fig 1）. pcDNA3.1FHIT转染组HepG2细胞裂解液通过Western blotting可检测到Mr 17 000的蛋白条带（Fig 2），未转染对照组和pcDNA3.1(+)转染组中未检测到FHIT蛋白的表达. 证实了构建的真核表达载体pcDNA3.1FHIT经转染后可在肝癌细胞HepG2中稳定过表达FHIT蛋白.

　　2.1细胞形态学细胞爬片的HE染色经生物显微镜观察，转染FHIT基因组细胞形态与空载体转染组细胞及未转染组细胞均伸展良好，3种细胞均呈多梭A: HepG2 cells;  B: pcDNA3.1HepG2 cells;

　　形或多角形，大小不等，可见核分裂像及多个核仁，未见明显变化. 透射电镜观察，转染空载体组细胞和未转染组的细胞，细胞超微结构无明显差异，细胞圆形、卵圆形较多，细胞表面微绒毛均较丰富，细胞核大，核质比例大，核的异形性明显，呈肾形、马蹄形，有些凹陷. 胞质透亮，染色质分布均匀，每个细胞内可见2～3个核仁. 核分裂较多见. 与转染空载体组和未转染组的细胞相比，转染FHIT组细胞大小不等，细胞表面的微绒毛减少. 核仁明显，核染色质轻度边集，内质网明显扩张，线粒体聚集，细胞质可见较多空泡、溶酶体及糖原（Fig 3）.

　　2.2细胞生长特性未转染组和空载体转染组细胞的生长、增殖速度相近，说明真核载体pcDNA3.1(+)对细胞的生长、增殖没有明显影响（Fig 4）. pcDNA3.1FHIT转染组的HepG2细胞的增殖速度比未转染组和空载体转染组细胞明显降低. 转染的肿瘤细胞株HepG2的细胞周期分布是G1=63.9%, S=33.6%,G2=2.5%，凋亡指数为2.005,未转染HepG2细胞周期分布是G1=61.3%,S=26.4%, G2=12.3%，凋亡指数为1.224,空载体组细胞株的细胞周期是G1=61.9%,S=26.7%,G2=11.46%，凋亡指数为1.305. 结果表明FHIT蛋白的重表达可阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡.

　　3讨论

　　FHIT在正常组织中均有表达， Zhao等［2］发现65%（50/83）HCC组织表现显著的FHIT表达缺失或低表达，并且与病理类型及肿瘤大小相关. Yuan等［3］发现HCC中FHIT基因的改变， 并发现它是一个常见的环境因素基因，且可能在肝癌发生中有一定的影响. 我们也对70例肝癌标本进行了免疫组化检测，发现高达58.6%的FHIT蛋白表达缺失，说明FHIT基因的低表达或失活在人肝癌中的发生率很高. 本实验中我们用脂质体介导法将pcDNA3.1FHIT导入肝癌细胞系HepG2中，G418选择培养，经免疫组化和Western blotting鉴定其表达. 表明pcDNA3.1FHIT在靶细胞内可稳定过表达FHIT蛋白.

　　研究发现，外源性FHIT蛋白的表达能诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期G1期阻滞［4］，但是也有研究提示，FHIT蛋白对肿瘤细胞的凋亡和细胞周期未造成影响［5］. 我们用电镜对转染后FHIT组细胞进行观察，发现大小不等，细胞表面的微绒毛减少，内质网明显扩张，线粒体聚集，细胞质可见较多空泡、溶酶体及糖原，这些现象说明细胞发生了凋亡早期改变和细胞蜕变. 从细胞的生长曲线可以看出,转染细胞HepG2FHIT生长缓慢,而对照组细胞HepG2生长明显,保持了恶性生长的特点. 流式细胞仪的检测表明，HepG2FHIT细胞G2期细胞比例低于对照组HepG2细胞，S期的细胞明显增多. 细胞的凋亡指数也由转染前的1.224上升为2.005. 这并不是DNA合成旺盛、细胞生长活跃，而是意味着FHIT基因是调节细胞周期中由S→G2的关卡，可以使G1延长,及S期细胞的明显增加，FHIT基因可能是通过诱导细胞S期阻滞和肿瘤细胞凋亡作用抑制人肝癌细胞的恶性生长. 此结果与其他研究者的结果不完全一致，可能是由于FHIT蛋白对不同肿瘤细胞效应不同，还是存在其他机制,有待深入的研究来阐明.

　　【】

　　［1］ 杨安钢，毛积芳，药立波. 生物化学与分子生物学实验技术［M］.北京:高等出版社，2001:489-493.

　　［2］ Zhao P, Song X, Nin YY, et al. Loss of fragile histidine triad protein in human hepatocellular carcinoma［J］. World J Gastroenterol, 2003; 9(6):1216-1219.

　　［3］ Yuan BZ, KeckWaggoner C, Zimonjic DB, et al. Alterations of the FHIT gene in human hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Res, 2000;60(4):1049-1053.

　　［4］ Ishii H, Dumon KR, Vecchione A,et al. Effect of adenoviral transduction of the fragile histidine triad gene into esophageal cancer cells［J］. Cancer Res, 2001;61(4):1578-1584.

　　［5］ Guo Z, Vishwanatha JK. Effect of regulated expression of the fragile histidine triad gene on cell cycle and proliferation［J］. Mol Cell Biochem, 2000;204(12):83-88.