丹参对肝癌致鼠梗阻性黄疸时VEGF表达的影响

【关键词】  肝肿瘤

    Effect of Danshen injection on VEGF expression in SD rats with malignant  obstructive jaundice  caused by hepatocellular carcinoma

　　【Abstract】 AIM:  To establish malignant biliary obstruction model of SD rats and to study the effects of Danshen injection on the tumor size, inhibition rates and metastasis rates of hepatocellular carcinoma and the expression of vascular endothelia cell growth factor (VEGF) in carcinoma and pericarcinoma tissues, adjacent lobe (leftinternal lobe) as well as lung tissues. METHODS:  Malignant biliary obstruction models of SD rats were  made by vaccination of transplanted tumor in liver near the porta hepatis with walker256 hepatocarcinoma cell line, which infiltrated and metastasized to proximal common bile duct and caused its narrowness and obstruction. The SD rats were divided into 4 groups: 0.9% NS (n=24), Inosine+VC (n=40), Danshen (n=40) and 5FU (n=40) respectively. The diameter of transplanted tumor, inhibition rates and metastasis rates of hepatocellular carcinoma and the expression of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues, adjacent lobe (leftinternal lobe) as well as lung tissues were observed. Statistical analysis was made.  RESULTS:  The diameter of the tumor was reduced and the inhibition rates and metastasis rates of hepatocellular carcinoma were upgraded after treatment of Danshen injection compared with those in the rats treated by 0.9% NS. and Inosine combined with VC (P<0.01), but the diameter of tumor was slightly downgraded after treatment of Danshen injection compared with that in the rats treated by 5FU (P<0.01). The inhibition rates（41.7%） and the liver metastasis rate (59.7% and 81.1%) of hepatocellular carcinoma in rats treated by Danshen injection were similar with those in the rats treated by 5FU (P<0.01). The expressions of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues were significantly downgraded after treatment of Danshen injection compared with those in the rats treated by 0.9% NS and Inosine combined with VC (P<0.01) and with those in the rats treated by 5FU (P<0.05). CONCLUSION:  Danshen can inhibit the growth of hepatocarcinoma in SD rat models of malignant biliary obstruction through reducing the proliferation of hepatocarcinoma cells, increasing the reversion of hepatocarcinoma cells and downregulating the expression of VEGF in carcinoma and pericarcinoma tissues.

　　【Keywords】 jaundice, obstructive; disease models, animal; liver neoplasms; Walker256 hepatocarcinoma cell line; vascular endothelial growth factor; Danshen

　　【摘要】 目的： 建立恶性梗阻性黄疸模型，通过对模型鼠ip丹参注射液，观察其对肝癌瘤体大小、抑癌率及抑转移率和肝癌、癌周、临近肝叶及肺组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达，评价其作用. 方法： 用Walker256肝癌株近肝门部肝实质内种植致移植性肝癌侵袭高位胆管，造成胆道癌性狭窄，以建立SD大鼠恶性梗阻性黄疸模型. 将模型鼠分成4组，通过对模型鼠腹腔内分别注射等量的生理盐水(n=24)、肌苷+VC(n=40)、丹参(n=40)和5FU(n=40). 观察肝癌瘤体大小、抑癌率及抑转移率和肝癌、癌周、临近肝叶及肺组织中VEGF的表达. 结果： 丹参组与生理盐水组和肌苷+VC组相比，肝癌平均瘤体减小(0.5±0.2) cm3、抑癌率（41.7%）及抑转移率(59.7%，81.1%)增高（P<0.01）；与5FU组相比，平均瘤体却较大（P<0.01）. 在抑癌率及抑肝转移率方面，丹参组除抑肺转移率外与5FU组相比无差异. 丹参组VEGF在肝癌组织和癌周组织中的表达率分别低于生理盐水组（P<0.01）、肌苷+VC组（P<0.01）和5FU组（P<0.05）. 结论：  丹参在肝癌致梗阻性黄疸时，通过促进肝癌细胞分化成熟、抑制肝癌细胞增殖、降低肝癌组织和癌周组织中VEGF表达，而对肿瘤起抑制作用.

　　【关键词】 黄疸，阻塞性；疾病模型，动物；肝肿瘤；Walker256肝癌株；血管内皮生长因子类；丹参
 
　　0引言

　　本实验用Walker256肝癌株近肝门部肝实质内种植致移植性肝癌侵袭高位胆管，造成胆道癌性狭窄，建立SD大鼠恶性梗阻性黄疸模型. 通过对模型ip不同的药物，肝癌、癌周、临近肝叶及肺组织中血管内皮生长因子（vascular endothelia cell grouth factor, VEGF）的表达，并对其结果进行统计学分析.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SD大鼠144只，体质量（225±25） g，另备雄性SD幼鼠10只，体质量（100±25） g，以供癌株传代用. 以上实验用鼠为西安大学医学院动物实验中心提供（均为近交系繁殖和封闭群体饲养）. Walker256肝癌细胞株用人乳腺癌肉瘤诱导传代培育而成的鼠肝癌株，由院上海细胞生物所提供，已稳定传代50次以上. 抗VEGF鼠单克隆抗体（Labvision com)、  Supervision免疫组化试剂盒（单抗鼠IgG）、Envision免疫组化染色剂盒（单抗鼠IgG）、DAB显色剂均由DAKO公司提供；复方丹参注射液（上海第九制药厂,批号00124509）.

　　1.2方法

　　恶性梗阻性黄疸模型的建立［1］: 将Walker256瘤株从液氮中复苏，在传代鼠腹腔内进行瘤株扩增后,注入传代SD幼鼠下肢内侧皮下. 5 d后，在无菌条件下摘出实体瘤，取边缘生长活跃的鱼肉样癌组织,切成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，置于冰生理盐水中漂洗后备接种用. 将SD大鼠用20 g/L戊巴比妥（1.3 mL/kg）ip麻醉后，常规消毒，行腹正中切口进腹，充分显露肝门，置手术放大镜视野下，在肝右叶与肝中叶的交界部距肝门5 mm处，用眼科镊逆胆管走行方向潜行造隧深约3 mm，植入备用的瘤块后，用棉签压迫止血. 依次关腹，结束手术. 常规饲养7 d，即可完成模型鼠的复制［1］. 将不合格的模型鼠剔除（接种失败、腹腔接种及无黄疸者）后，随机分成4组： A组（生理盐水组）24只，ip NS，剂量为10 mL/kg×7 d. B组（肌苷+VC治疗组）40只，ip肌苷、VC各5mL/kg ×7d. C组（丹参治疗组）40只，ip丹参10 mL/kg×7 d. D组（5FU组）40只，ip 300 mg/kg×7 d. 结果实际得到观察数为A组16只、B组26只、C组34只及D组30只. 将4组实验鼠分别ip不同药物7 d后，用乙醚开放吸入麻醉后，行正中十字切口入腹，沿胸骨正中打开胸腔，迅速剪开心包行左心室插管，先快后慢灌注生理盐水100 mL和40 g/L多聚甲醛（0.1mol/L）PB固定液300 mL，剪开右心耳放血. 待全身灌注固定完全后，切取肝脏及肿瘤、肺脏标本. 将组织块放入40 g/L多聚甲醛溶液中，选材、脱水及石蜡包埋. 记录肿瘤体积、肝内转移灶数目及肺转移情况，并： 肿瘤体积=长径×短径2÷2，抑瘤率=［（对照组平均瘤体-实验组平均瘤体）÷对照组平均瘤体］×100%，抑转移率=［（对照组平均转移率―实验组平均转移率）÷对照组平均转移率］×100%. 将选取肝瘤组织、瘤周组织、邻近肝近肝叶（左内叶）及肺组织行HE染色，进行组织病检查；同时选取肝癌、癌周中VEGF表达的免疫组化检查.
统计学处理：  计量资料以x±s表示，使用 SSPS 11.0统计软件对多组计量资料进行KruskalWallis H检验，对计数资料进行R×C 表χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1形态学观察A组肝癌生长良好，异型性高，瘤体大于1 cm3时可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周血管丰富，管径大小不一，分布密集(Fig 1). B组肝癌生长良好，异型性高，瘤体体积大于1 cm3时可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周血管丰富，管径大小不一，分布密集. C组肝癌生长不良，异型性低，成熟分化比率高，肝癌组织中癌细胞呈片状病变区，周边部以细胞凋亡为主，而中心部以细胞坏死为主. 瘤体体积小于1 cm3时就可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周血管稀少，管径大小均匀，散在分布. D组肝癌生长不良，但异型性高. 瘤体体积大于1 cm3时才可见瘤体中心部干酪样坏死；癌周血管稀少，管径大小不一，分布集中.

　　2.2肝癌生长转移的影响丹参组抑瘤率明显高于肌苷+VC保肝对照组(P<0.01)；而与5FU抗癌对照组抑瘤率相比，虽数值上较低，但无统计学意义. 丹参组抑制肝内转移率和抑制肺部转移率明显高于肌苷+VC保肝对照组(P<0.01）；与5FU抗癌对照组相比，在抑制肝内转移率方面数值相近；而在抑制肺部转移率方面，数值上高于5FU组，但差异无统计学意义(Tab 1).表1各组模型鼠腹腔内不同药物注射对肝癌生长转移的影响（略）
 
　　2.3肝癌、癌周、临近肝叶（肝左内叶）组织VEGF的表达丹参组肝癌、癌周VEGF(Fig 2)的表达例数均明显低于生理盐水组(Fig 3)和肌苷+VC组(P<0.01）. 而在临近肝叶（肝左内叶）及肺组织中丹参组VEGF的表达例数与生理盐水组和肌苷+VC组相比，无统计学意义. 与5FU抗癌对照组相比，虽数值上表达较低，但无统计学意义(Tab 2).表2肝癌、癌周、临近肝叶及肺组织中VEGF的表达（略）

　　3讨论

　　恶性梗阻性黄疸是普外科常见症候群，其发病肝脏局部而危及全身脏器，引起不可逆的病理生理改变，故在围手术期处理方面历来受到医学界的高度重 视. VEGF是主要的促血管生长因子，是肿瘤血管形成的关键因素［2］，是肝癌细胞浸润和转移的基础. 以往对丹参的非瘤疾病的药理作用研究较彻底［3］，如抗血板聚集、改善微循环、调节血液流变学、增强机体免疫、逆转慢性肝病纤维化作用、调节血脂、抗脂质过氧化作用及对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用，并在临床得到广泛应用，取得较满意的疗效. 但丹参对肿瘤细胞的细胞毒杀伤作用、诱导肿瘤成熟分化、促进肿瘤细胞凋亡等机制研究甚少. 近年来随着抗癌中药研究的日益深入，丹参抗肿瘤的基础和临床研究得以重视. 本实验观察显示，丹参组肝癌平均瘤体减小、抑癌率及抑转移率增高，丹参组VEGF表达在肝癌组织与正常肝细胞交界处表达丰富，肝癌组织中心部VEGF表达反而减少；形态学肿瘤血管管径较粗、大小均一. 癌组织中瘤体体积小于1 cm3可见干酪样坏死，提示丹参在肝癌致梗阻性黄疸时，通过促进丹参诱导肝癌细胞成熟分化［4］，降低肝癌、癌周组织中VEGF表达，阻止肝肿瘤血管形成等机制而对肿瘤起抑制作用.

　　【】

　　［1］ 夏荣龙，刘青光，倪卫东，等. 恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价［J］. 西安医科大学学报，2001;22（5）：350-351.

　　Xia RL, Liu QG, Ni WD, et al. The establishment and evaluation of malignant biliary obstruction model on the SD rats   ［J］. J  Xian Med Univ, 2001;22（5）：350-351.

　　［2］李晓明，汤钊猷，周洛，等. 血管内皮细胞生长因子的表达与肝癌细胞浸润和转移的关系［J］. 中华肿瘤杂志，1998;20：12-14.
  
　　Li XM, Tang ZY, Zhou L, et al.  Expression of vascular endothelial growth factor correlates with invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma ［J］.Chin J Oncol January, 1998;20:12-14.

　　［3］梁勇,羊裔明,袁淑兰. 丹参酮药理作用及临床研究进展［J］. 中草药，2000;31（4）：304-306.
 
　　Liang Y, Yang YM, Yuan SL. Danshentong  pharmacological effects  and development of clinic research ［J］. Chin Trad Herb Drug,  2000;31（4）：304-306.

　　［4］ 夏荣龙，刘青光，潘承恩，等. 丹参对肝癌致梗阻性黄疸时增殖细胞核抗原表达的作用［J］. 西安大学学报(医学版)，2004；25（3）：247-249.