bFGF对兔骨髓基质细胞VEGF因子表达及细胞生物行为的影响

        作者：常祺 刘建 胡蕴玉 孟国林 白建萍 彭磊

【关键词】  血管内皮细胞生长因子

　　Effect of bFGF on VEGF expression and biological behavior of marrow stromal cells

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and the biological behavior of marrow stromal cells. METHODS: The marrow stromal cells of the femur of rabbits were procured and cultured. The samples were treated with different doses of bFGF and the control was not treated. Five days later, the effects were observed by histopathological analysis, cells multiplication, alkaline phosphatase activities detection, the computer analysis of bone clusters and the detection of ratio of VEGFpositive cells. RESULTS: There was statistically significant difference between different dose groups in all the detection items and the results of treatment groups were all better than that of the control group. CONCLUSION:  bFGF can stimulate both the multiplication and osteogenic potential of marrow stromal cells in a dose dependent manner and the best dose of bFGF is 1200 kU・L-1.

　　【Keywords】 vascular endothelial growth factor; basic fibroblast growth factor; marrow stromal cell

　　【摘要】 目的： 观察兔骨髓基质细胞经bFGF刺激后，其VEGF因子表达及细胞生物行为的变化. 方法： 取兔双侧股骨骨髓基质细胞，采用骨髓基质细胞体外培养技术，分别以不同剂量bFGF刺激细胞，并设立空白对照组. 培养5 d后，进行细胞形态（HE染色）、增殖情况（细胞记数法与MTT法）、碱性磷酸酶（改良钙钴法染色）、成骨结节（图像分析）、VEGF阳性细胞率（免疫组化染色）等项目的检测. 结果： 不同剂量组间各项观测指标差异均显著，结果均优于空白对照组. bFGF促进细胞增殖与VEGF表达最佳剂量为1200 kU・L1. 结论： bFGF能促进骨髓基质细胞增殖，促进VEGF的表达，其剂量与效果间存在明显相关关系. bFGF为1200 kU・L-1时，促进骨髓基质细胞表达VEGF及促进细胞增殖作用同时达到最佳效果.

　　【关键词】 血管内皮细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；骨髓基质细胞

　　0引言

　　组织工程骨的再血管化问题一直阻碍着组织工程技术在骨科领域的. 血管内皮生长因子（VEGF）是机体内促进血管生长最重要的生长因子，在骨的形成及修复中也起到重要的作用，其表达水平直接影响到以后成骨的血供，影响到成骨的速度和质量［1,2］. 骨髓基质细胞是骨组织工程中一种常用的种子细胞，骨髓基质细胞中所包含的许多细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、巨嗜细胞等都可分泌表达VEGF. 如何刺激骨髓基质细胞，促进VEGF的分泌则成为增加VEGF表达的另一重要手段. 我们采用不同剂量bFGF刺激体外培养的兔骨髓基质细胞，观察其VEGF因子表达改变，并参照细胞生物行为的变化，为临床应用提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料幼兔1 wk龄，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供. DMEM培养基，胎牛血清，L谷磷酰胺，地塞米松，Vit.C等购自Sigma公司，bFGF试剂购自双鹭公司， VEGF mAb及SP试剂盒购自迈新公司. 骨髓基质细胞原代培养：取幼兔杀死，在无菌条件下取出双侧股骨和肱骨，去除骨外膜，DMEM液冲洗3次，用注射器反复冲洗骨髓腔，冲出的骨髓细胞接种于装有适量培养液（DMEM培养基，含100 mL・L-1胎牛血清）的培养瓶中，置于50 mL・L-1 CO2培养箱中37℃恒温培养，24 h后吸出悬浮细胞，用DMEM液冲洗后，留下贴壁细胞继续培养. 而后隔日换液，观察细胞生长情况. 细胞融合成片，长满培养瓶底部后，用2.5 g・L-1胰蛋白酶消化，传代培养.

　　1.2方法将bFGF试剂溶解于DMEM中，针头滤器过滤除菌. 第4代细胞传代后，分别用含bFGF 0，200，400，600，800，1000，1200和1600 kU・L-1的血清培养液培养，同时分组. 取第4代骨髓基质细胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bFGF达到预期浓度，调整细胞密度至1×107 L-1，接种于50 mL培养瓶. 置于37℃、饱和湿度、50 mL・L-1 CO2培养箱内培养. 隔日换液. 每4～6 h在倒置显微镜下观察细胞形态. 另取第4代细胞，传代后调整细胞密度至1×107 L-1，接种于50 mL培养瓶（瓶中预先置入盖玻片），培养4 d后，取出盖玻片，PBS冲洗3次，750 mL・L-1乙醇固定，行HE染色(Fig 1). 取第4代骨髓基质细胞，以消化法传代后，按以上分组方法加入不同剂量bFGF，调整细胞密度至1×107 L-1，接种于24孔培养板内，放置于培养箱内，隔日换液. 细胞培养5 d后以胰蛋白酶消化，用细胞记数板记数细胞，每孔重复3次，取均值. 细胞培养5 d后，每孔加入MTT溶液（5 g・L-1）20 μL，温箱内培养4 h后，吸弃孔内上清，每孔内加入150 μL纯DMSO，震荡10 min，使结晶充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度A值.

　　图1兔骨髓基质细胞染色　(略)

　　1.2.1碱性磷酸酶（ALP）第4代培养细胞长满后，胰酶消化制成密度为1×107 L-1的细胞悬液，接种于事先放入盖玻片的24孔板内，按1.2分组方法加入不同剂量bFGF. 培养5 d后取出盖玻片，4℃生理盐水冲洗，置于冷丙酮中固定15 min，而后用改良钙钴法染色(Fig 2). 去除上清，用10 mmol・L-1 PBS冲洗3次，吸干，每孔加1 mL・L-1 Triton X100  50 μL置4℃冰箱过夜，镜下观察已无明显细胞结构，经反复吹打后加入ALP检测试剂盒内新配置的底物100 μL/孔，温箱内30 min，每孔加0.2 mol・L-1 NaOH 50 μL终止反应. 在酶联免疫检测仪上选择410 nm波长检测各孔吸光度A值.

　　图2兔骨髓基质细胞碱性磷酸酶染色，以胞质内有黑色颗粒堆积者为阳性　(略)

　　1.2.2体外成骨能力测定取第4代骨髓基质细胞，传代后按1×107 L-1细胞密度接种于有条形盖玻片的培养瓶内，加入条件培养液，按1.2分组方法加入不同剂量bFGF. 置于标准环境下培养，隔日换液1次，连续观察细胞生长情况，记录钙化结节形成过程，培养4 wk后取出盖玻片,在取出之前加入终浓度为100 mg・L-1的四环素溶液，继续培养30 min，后取出盖玻片，PBS液冲洗3次，置于荧光显微镜下观察，而后用40 g・L-1多聚甲醛固定，行Von Kossa法钙染色，做图像分析，随机抽取不同视野6次，平均矿化面积百分比.

　　1.2.3VEGF免疫组化染色取第4代细胞，传代后调整细胞密度至1×107 L-1，接种于事先放入盖玻片的24孔板内，按1.2分组方法加入不同剂量bFGF.

　　图3兔骨髓基质细胞VEGF免疫组化染色　(略)

　　培养5 d后（中间换液1次），取出盖玻片. 采用SABC法检测VEGF基因的表达. Ⅰ抗按1∶30加在玻片上，4℃过夜后，加入SABC 37℃反应20 min，PBS洗2次. 最后用DAB显色，苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片，显微镜观察并摄片. VEGF免疫组化染色，以胞质和（或）胞膜有明确棕黄色着色者为阳性细胞(Fig 3). VEGF阳性部位主要位于胞质，细胞外基质也可见阳性反应. 随机记数高倍视野，计算阳性细胞率.
统计学处理： 所测数据用SAS统计分析软件处理，数值用x±s表示，并经方差分析检验差异显著性.

　　2结果

　　经方差齐性检验，细胞记数、MTT检测、ALP活性、矿化面积百分率符合方差齐性，F值分别为65.50, 22.47, 11.12和8.33, P<0.01，显示细胞增殖情况、ALP活性、矿化面积百分率、VEGF阳性细胞率各剂量组间差异均显著；在VEGF阳性细胞率检测指标上，各剂量组间方差不齐，使用非参数统计的秩和检验，H=49.682>χ2，P<0.01，认为各剂量组间差异也有显著性意义.

　　结合各剂量组均值与SNKq检验，显示bFGF对刺激骨髓基质细胞增殖及表达VEGF有明显促进作用，并存在明显的剂量依赖关系,其最佳剂量为1200 kUL-1左右，高于此剂量则有下降趋势，表现出双向作用. ALP活性及矿化面积百分率检测，各剂量组间差距无明显性(Tab 1, 2).

　　表1－表2　(略)

　　3讨论

　　bFGF是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物中长入，加速需要血供的软骨内化骨，bFGF可以升高大鼠骨髓基质细胞中钙化结节形成率及骨钙素水平［3］，还可提高鼠成骨样细胞中主要表达连接蛋白的表达水平［4］，并且都具有剂量依赖性. VEGF作为促使内皮细胞增殖、趋化的特异性细胞素，在骨形成与代谢中过程中发挥着重要的作用［5］. 我们选取具有强的成骨潜能和多向分化能力的骨髓基质细胞［6］作为靶细胞，并用不同剂量bFGF加以诱导. 从统计数据结果分析， bFGF对刺激骨髓基质细胞表达VEGF有明显促进作用，并存在明显的剂量依赖关系. 其最佳剂量为1200 kU・L-1左右，高于此剂量则有下降趋势，表现出双向作用. 同时，bFGF对于骨髓基质细胞还表现出明显促增殖作用，细胞的增殖周期随着bFGF浓度的增加而缩短，当bFGF的浓度为1200 kU・L-1时，促增殖作用达到最强. 在促进骨髓基质细胞成骨潜能方面，单独应用bFGF无明显作用. 骨组织工程中，种子细胞与支架结合后的增殖过程并不快，另外，植入的骨组织在宿主体内良好的生长是也骨组织工程研究中的一个课题. bFGF具有明显促进骨髓基质细胞增殖的作用，还可通过促血管壁细胞增生的重要介质VEGF促进血管内皮细胞有丝分裂并增强其分化，二者协同作用，加强局部血管增生、渗入和增加局部血流量［7］，从而可以较好的解决上述问题，加速骨形成及修复过程. 但是，在骨组织工程中单独应用bFGF也有其不足之处，如果将其与其他一些可以促进骨髓基质细胞成骨表达的细胞因子联合应用，也许会取得更好的效果［8］.

　　【】

　　［1］ Nakagawa M, Kaneda T, Arakawa T, Morita S, Sato T, Yomada T, Hanada K, Kumegawa M, Hakeda Y. Vascular endothelial growth factor (VEGF) directly enhances osteoclastic bone resorption and survival of mature osteoclasts ［J］. FEBS Lett, 2000;473(2):161-164.

　　［2］ Peng H, Wright V, Usas A, Gearhart B, Shen HC, Cummins J, Huard J. Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cellexpressed VEGF and bone morphogenetic protein4 ［J］. J Clin Invest, 2002;110(6):751-759.

　　［3］ Ding SL， Sun ZY. Effects of fibroblast growth factor on rat bone marrow osteoblast in vitro ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2003;24(2):119-122.

　　［4］ Hong X, Duan YZ, Zhang SZ, Liu X, Zhou HX. Effects of bFGF on Cx43 expression on rat osteoblastoid cells ROS17/2.8 ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2001;22(19):1755-1758.

　　［5］ Carlevaro MF, Cermelli S, Cancedda R, Descalzi Cancedda F. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in cartilage neovascularization and chondrocyte differentiation: Autoparacrine role during endochondral bone formation ［J］. J Cell Sci, 2000;113(Pt 1):59-69.

　　［6］ Cao G, Mao TQ, Xi Q, Chen FL. Biological characteristics of human bone marrow stromal stem cell cultured in vitro ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2002;23(3):207-209.

　　［7］ Wong CG, Rich KA, Liaw LH, Hsu HT, Berns MW. Intravitreal VEGF and bFGF produce florid retinal neovascularization and hemorrhage in the rabbit ［J］. Curr Eye Res, 2001;22(2):140-147.

　　［8］ Du JJ, Luo ZJ, Hu YY, Li ZC, Lv R. A suitable carrier for bFGF in osteoinduction by rhBMP2 enhanced by bFGF ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(12):1489-1491.