A型肉毒毒素抑制大鼠变应性鼻炎鼻溢及VIP在鼻腔粘膜的免疫表达
【关键词】 BTX
Inhibition of rhinorrhea with botulinum toxin type A and the expression of VIP on nasal mucosa in allergic rhinitis rat
【Abstract】 AIM: To study the effect of Botulinum toxinA (BTXA) on inhibition of rhinorrhea, expression and morphological change of Vasoactive intestinal polypeptide (VIP) at nasal mucosa, in allergic rhinitis (AR) rats. METHODS: Ovalbumin sensitized the rat to establish allergic rhinitis model. Rats were divided into control group (n=6), allergic group (n=10), allergic rats treated with BTXA (AR+BTXA) group (n=5). VIP immunoreactivity at nasal mucosa in the allergic rhinitis rats was studied by immunohistochemistry. The morphological changes at nasal mucosa were observed by histological staining methods. RESULTS: The symptoms of allergic rhinitis, nasal rhinorrhea and sneezing, were remarkably augmented after ovalbumin application. The nasal rhinorrhea symptom diminished after BTXA treatment. The quantity of nasal secretion was significantly reduced in （AR+BTXA） group as compared with that in allergic group (P0.05). The nasal sneezing symptom in AR+BTXA group was not significantly different with that in the allergic group. Hematoxylin and eosin staining demonstrated that no edema, small vessels were found in AR+BTXA group, but edema, vasodilational and inflammation cell infiltration were observed in the allergic group. Immunohistochemical study revealed that VIP immunoreactive fibers at the nasal mucosa decreased markedly after BTXA application, but a large number of VIP fibers were observed in the allergic group. CONCLUSION: Local BTXA treatment is a selective and nontraumatic method to reduce a long lasting desensitization of the nasal mucosa，to alleviate nasal congestion，rhinorrhea and sneezing, and to reduce the sensory neuron sensitivity of the mucosa.
【Keywords】 BTXA; allergic rhinitis; rhinorrhea; vasoactive intestinal polypeptide; rats
【摘要】 目的: 确定A型肉毒毒素(BTXA)对大鼠变应性鼻炎鼻溢是否具有的作用，以及毒素使用前后血管活性肠肽（VIP）免疫表达和组织学改变. 方法: 卵清蛋白（Ovalbumin）致敏Wistar大鼠制作变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)动物模型，16只大鼠随机分为3组，即对照组（n=6）；致敏组（n=10）；致敏后A型肉毒毒素（BTXA）用药组（n=5）. 观察给予BTXA前后大鼠鼻部症状和体征的变化. 采用组织学和免疫组织化学方法观察鼻腔粘膜形态学改变以及对VIP物质表达的影响. 结果: ①致敏组动物鼻分泌量明显增多. 组织学结果显示：致敏组鼻腔粘膜水肿、腺体增生、嗜酸性粒细胞增多. 免疫组织化学结果显示：致敏组腺体周围VIP纤维密集，呈束状. ②致敏后BTXA用药组，鼻分泌量明显减少，致敏后BTXA用药组与致敏组相比鼻分泌量差异有显著性（P0.05），但鼻痒及喷嚏症状无明显改变. 组织学结果示：鼻粘膜上皮完整，腺体明显减少，腺管萎缩. 免疫组织化学结果示：致敏组动物致敏后 BTXA 用药组腺体周围VIP纤维减少，未见束状VIP纤维. 结论: BTXA能缓解变应性鼻炎流涕，VIP纤维密度和数量免疫阳性反应减少，能治疗变应性鼻炎的鼻溢症状.
【关键词】 BTXA；变应性鼻炎；鼻溢；VIP；大鼠
0引言
1978年美国旧金山眼科研究所Scott医生将A型肉毒毒素(botulinum toxinA, BTXA)应用于斜视的治疗，取得良好疗效. 198912美国FDA正式批准BTXA为临床治疗药物，成为世界上第一个用于临床的微生物毒素. 1987年我国以王荫椿教授为首的生物制剂专家经10余年的潜心研究，继美国、英国之后，研制成功BTXA，1997年经国家卫生部审批通过，成为第一个微生物毒素注射治疗疾病的生物制剂新药. 根据BTXA不阻断神经兴奋的传导，而只作用于运动神经末梢的神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡上的一种膜蛋白，产生暂时性的神经递质的阻断和抑制突触前膜乙酰胆碱的释放，致使肌肉麻痹的作用原理. 我们拟通过制作变应性鼻炎动物模型，观察BTXA对致敏动物鼻腔粘膜的影响，为临床治疗变应性鼻炎提供新途径及实验依据.
1材料和方法
1.1材料成年健康雌性Wistar大鼠16只，体质量200～250 g，由兰州医学院实验动物中心提供. 微量移液器（梅特勒托利仪器有限公司）；天平（AR1140C型）；Olympus BH2型显微镜（日本）. 结晶型A型肉毒毒素（BTXA,50 U/A，兰州生物制品研究所提供）；卵清蛋白 (Ovalbumin, A5253 Sigma，美国) （华美生物制品有限公司）；氢氧化铝，上海化学试剂厂；VIP多克隆抗体（BA0126 效价1∶200）、SABC试剂盒（SA1022）和DAB显色试剂盒（ED1022）均为博士德生物制品有限公司； 多聚甲醛（分析纯，上海溶剂厂）；枸橼酸三纳及枸橼酸（分析纯，沈阳化工试剂厂）.
1.2方法
1.2.1大鼠变应性鼻炎模型的建立以卵清蛋白0.3 mg作抗原，氢氧化铝粉末30 mg作佐剂，加生理盐水1 mL配成混悬液，腹腔注射，隔日一次，共7次. 腹腔注射完成后，每侧鼻腔均以100 g・L-1卵清蛋白10 μL用微量移液器滴鼻，每日1次，共7次.
1.2.2模型评价于末次鼻腔致敏后30 min内，观察动物搔鼻动作，喷嚏、鼻溢液和觅食行为，以上各项指标均采用叠加量化记分法，总分大于5分表示模型成功.
1.2.3记分鼻痒：轻搔鼻1~2次为1分，剧烈抓挠鼻面不止3分，介于二者之间为2分. 喷嚏：1~3个为1分；4~10个为2分；11个以上为3分. 清涕：流至前鼻孔为1分；超出前鼻孔为2分；涕流满面为3分.
1.2.4分组及给药16只大鼠随机分为3组，对照组（Control group, n=6），卵清蛋白致敏组(Allergic animal, n=10)，致敏后BTXA用药组(Allergic animal + treaded with BTXA, n=5). BTXA用药组动物于致敏结束后第2日，在100 mL・L-1水合氯醛（3 mL・kg-1）麻醉下于右侧鼻腔内填入浸有BTXA（使用前以无菌生理盐水按比例稀释，10单位,0.1 mL）的棉条，放置1 h后取出. 对照组及致敏组动物均在同样麻醉条件下，于右侧鼻腔内填入浸有生理盐水的棉条（剂量同BTXA组）. 同样放置1 h后取出. 自给药后第2日起每2日给致敏组及BTXA用药组大鼠鼻腔滴入100 g・L-1卵清蛋白10 μL激发1次，观察症状和体征.
1.2.5症状和体征观察每次激发后观察动物30 min，内容包括鼻分泌量、鼻痒及喷嚏数目，鼻分泌量用滤纸法收集，滤纸条称质量后放入鼻腔. 30 min后取出并称质量，鼻分泌量，数据做统计分析.
1.2.6组织学及免疫组化观察取材:于用药后第10日，各组动物以100 mL・L-1水合氯醛（4 mL・kg-1）全身麻醉，开胸经左心室插管至主动脉进行灌注，先用100 mL生理盐水冲净血液,再后续40 g・L-1多聚甲醛0.1 mol・L-1 PBS (pH 7.4) 500 mL灌注固定. 取右侧鼻呼吸区粘膜并置于上述固定液中后固定24 h. 组织学及免疫组织化学准备, 取右侧鼻呼吸区粘膜依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋后，石蜡切片机（AO820型，美国）切片，片厚4 μm；切片贴于涂有多聚赖氨酸（Sigma，美国）的载玻片上，置于4℃冰箱保存备用. 每组隔片取样5张，分别进行ＨＥ染色及免疫组化检测. 血管活性肠肽VIP免疫组化检测采用抗生物素生物素过氧化物酶复合物法（SABC法）. 染色程序：切片脱蜡至水. 滴加新鲜配制的30 mL・L-1过氧化氢液，室温（20℃）10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗2 min×3次. 滴加复合消化液5~10 min. 蒸馏水洗3次. 滴加正常山羊血清封闭液，37℃孵育20 min, 不洗，甩干. 兔抗 VIP多克隆抗体，4℃过夜，10 mmol・L-1PBS漂洗3 min×3次. 滴加羊抗兔 IgG，37℃孵育20 min，10 mmol・L-1PBS漂洗min×3次. 滴加SABC，37℃孵育20 min，10 mmol・L-1PBS漂洗5 min×4次，DAB显色：取1 mL蒸馏水，分别加入试剂盒中A,B，C试剂各1滴，混匀后加至标本片上，镜下控制显色时间，双蒸水终止反应. 苏木素轻度复染，脱水、透明、封片. 光镜下观察，Olympus BH2型显微镜摄片. 对照组以正常兔血清代替一抗，其余步骤同上.
1.2.7免疫组化结果观察血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide, VIP）阳性细胞定位于大鼠鼻腔粘膜上皮细胞、腺泡及其导管上皮细胞胞质，而小血管周围有VIP免疫反应阳性纤维，染色呈棕黄色.
统计学处理: 所有数据均应用SPSS 10.0软件进行统计学处理. 结果以x±s表示. 采用重复测量资料的方差分析进行数据处理.
2结果
2.1症状和体征对照组鼻液分泌量无明显变化，少量为清水涕，喷嚏及抓痒次数无增多，鼻周皮肤无红肿. 卵清蛋白致敏后，鼻液明显增加，多为清水涕，喷嚏及抓痒次数增多，鼻周皮肤红肿. 致敏加BTXA组，鼻分泌量明显减少，喷嚏及抓痒次数减少，鼻周皮肤红肿减轻. 用药后第1日，致敏加BTXA组动物鼻分泌量减少，与致敏组相比差异有显著性(P0.05). 至用药第3日致敏加BTXA组动物鼻分泌量明显减少，与致敏组相比有显著差异（P<0.001）. 而至用药第7日致敏加BTXA组动物鼻分泌量已接近对照组（P>0.05）. 致敏加BTXA处理后第1，3，5和7日组间效应显著(P<0.05). 鼻分泌量第7日降至最低点，遂进入平台期，第9日致敏加BTXA组与致敏组相比差异显著(P<0.001), 与对照组相比差异不显著(P>0.05, Tab 1).
表13组动物卵清蛋白激发后不同时间鼻分泌量的变化 (略)
2.2喷嚏及鼻痒症状的改变对照组鼻喷嚏及抓痒次数无增多，鼻周皮肤无红肿. 卵清蛋白致敏后，致敏组鼻液明显增加，多为清水涕，喷嚏及抓痒次数增多，鼻周皮肤红肿. 致敏加BTXA组，鼻分泌量明显减少，喷嚏及抓痒次数较致敏组无明显变化，鼻周皮肤红肿减轻. 鼻痒及喷嚏症状在BTXA用药前后无明显变化.
2.3组织病改变对照组鼻粘膜上皮层完整，固有层可见腺细胞、腺管以及毛细血管，未见炎性细胞浸润. 致敏组上皮层不完整，固有层内有腺体大量增生，可见散在分布的以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润. 致敏加BTXA组上皮结构基本完整，腺泡细胞减少，腺管细胞胞质疏松，轻度萎缩（Fig 1～3）.
2.4VIP物质免疫组化免疫组化染色发现对照组鼻粘膜可见有少量VIPIR纤维散在分布于上皮与细胞间，在小静脉周围可见VIPIR纤维. 致敏组鼻粘膜腺管细胞胞质呈VIP免疫反应阳性，染色深. 致敏加BTXA组腺管周围未见VIPIR纤维，腺管上皮细胞VIP染色明显减弱（Fig 4～6）.
图1－图6 (略)
3讨论
神经肽（NP）［1-3］与变应性鼻炎［4］ (allergic rhinitis， AR)的关系是近年鼻研究的重点之一，近年来的研究加深了对鼻粘膜神经末稍分布及NP参与AR机制的认识. 迄今已在人及啮齿类动物的鼻腔发现并定位了数种NP. 拟副交感性神经肽以血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)为代表，主要由副交感神经节后纤维所释放，并与乙酰胆碱（Ach）共存（colocalization）. NP在炎症反应的不同阶段及不同解剖位点发生作用，但总的作用效果是扩张动脉、增加血管通透性、促进浆液腺和粘液腺的分泌.
AR发病机制与感觉神经中无髓C型感觉神经传入纤维的高敏感性有关，变应原物质进入鼻腔后刺激鼻粘膜引起感觉神经末梢大量释放神经递质，如P物质、VIP及降钙素基因相关肽(calcitonin gene relatedpeptide，CGRP)等，从而导致血浆蛋白渗出，而且腺体分泌增加形成神经原性炎症并诱发喷嚏反应.
肉毒毒素A是肉毒梭菌产生的一种高分子蛋白的神经毒素，引起人和动物肉毒中毒，死亡率很高. 肉毒中毒的松弛性麻痹，是由毒素对周围神经，特别是胆碱能神经的作用引起的，作用部位是胆碱能运动神经末梢［5-8］. 由于发现中毒机体的神经仍能传导正常冲动，而它的效应器在直接刺激时仍能收缩，所以认为毒素是作用于神经肌肉的接点，即突触处，作用在突触前膜，而不是突触后的效应器肌肉上. 肉毒毒素的作用过程包括三个不连续的阶段：第一阶段结合阶段. 毒素结合于神经末梢表面受体，结合是快速的，基本上是可逆的，属于细胞外的，抗毒素此时仍能对它起作用. 第二阶段定位阶段，毒素本身或其一部分进入神经膜，即离开了抗毒素能接近的部位，这称为毒素的内转(internalization). 这种内转是逐步的、有限的，虽然机制不详，但认为它不是一种被动的扩散，而是一种主动的过程，也许是吸附性胞饮现象，也许是蛋白载体或通道的形成. 第三作用过程麻痹阶段. 这是最重要的阶段，由此而发生麻痹过程. 毒素一旦结合于神经内面，囊泡就不再与神经膜融合而释放它所储存的乙酰胆碱. 如盐酸胍和4氨基吡啉都是通过钙离子的作用而奏效的，而肉毒毒素将以一种酶击（enzymatic attack）的形式对钙促进介质释放进行限制. 钙能促进介质的释放，达到对抗和缓解肉毒毒素的作用，抑制乙酰胆碱释放的药物由于毒素作用于神经末梢，对抗Ca2+触发的乙酰胆碱的释放过程，抑制神经介质乙酰胆碱的同时，也抑制拟副交感性神经肽VIP释放，从而导致血浆蛋白渗出减少，使鼻分泌量症状明显减轻［9-11］.
本研究用卵清蛋白建立大鼠AR模型［12-16］， BTXA滴注过敏鼻腔抑制释放鼻神经肽，鼻粘膜VIP的免疫组化表达及BTXA是具有抑制VIP减少鼻溢，结果表明肉毒毒素具有明显抑制或消除AR临床表现的作用，使鼻分泌量症状明显减轻. 组织学显示，经肉毒毒素处理后，炎性细胞明显减少，粘膜结构恢复正常，VIPIR纤维密度和数量减少，表明VIP通过抑制感觉神经超敏性，而使过强的免疫反应恢复至基本正常状态. 研究表明，VIPIR纤维在AR发病机制中具有重要作用. BTXA对大鼠AR过程，在减轻AR鼻溢的同时，VIP释放减少. 而达到治疗AR的作用.
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