HLA?I类基因多态性与白血病易感性的关联性研究

【摘要】  目的 探讨白血病易感性与HLA?I类基因多态性之间的关联性，寻找白血病的易感基因。方法 采用序列特异性寡核苷酸探针杂交技术(PCR?SSO)对65例白血病患者和48例正常对照组健康者进行HLA?A、B基因分型。结果 在等位基因HLA?A、B中，白血病患者的HLA?A01、B38基因的基因频率高于正常对照组(P<0.05)，而HLA?A11基因的基因频率明显下降(P<0.05)。结论 基因A01、B38对白血病有遗传易感作用，而基因A11对白血病有遗传拮抗作用。

【关键词】  HLA；白血病；PCR?SSO；多态性

　　Correlation between gene HLA?class I　polymorphism and susceptibility to leukemia

　　ABSTRACT: Objective  To explore the correlation between gene HLA?class I polymorphism and susceptibility to leukemia in Chinese Gansu Han people and search for the genes susceptible to leukemia. Methods  HLA?A and B alleles polymorphism in 65 patients with leukemia and 48 normal subjects were determined by PCR with sequence specific oligucleotide probe (PCR?SSO). Results  The allele frequencies of HLA?A01 and B38 were increased (P<0.05), while the allele frequencies of HLA?A11 were decreased in patients with leukemia (P<0.05). Conclusion  HLA?A01 and B38 alleles seem to contribute to the genetic susceptibility to leukemia, while HLA?A11 seems to contribute to its genetic resistance.

　　KEY WORDS: human leukocyte antigen (HLA); leukemia; PCR?SSO; polymorphism

　　近30年来，尽管白血病的基础研究和临床疗效有了长足进展，但白血病的确切发病机制尚不清楚。多数学者认为，白血病除了与外界环境因素如物理、化学、生物等有关外，不同患者对白血病的遗传易感性及免疫功能不尽相同[1]，具有高度多态性。与抗原呈递和识别有关的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分子，可能是导致白血病的重要遗传因素之一[2]。本研究采用聚合酶链反应和序列特异性寡核苷酸探针(polymerase chain reaction?sequence specific olignuliotide probe, PCR?SSO)的方法，对甘肃省汉族白血病患者HLA?I类基因A、B进行基因分型，研究其基因多态性与白血病的相关性。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象  病例组：兰州大学第一1998-2006年收住的部分白血病患者65例，按照白血病的形态学免疫学细胞遗传学分子生物学(MICM)分型法诊断标准确诊。年龄在2-71岁，平均年龄30岁，其中男性45例，女性20例。正常对照组：按照随机原则，选取同时期同一地区48例与患者无血缘关系的正常健康者。年龄在18-50岁，其中男性26例，女性22例。白血病患者前和对照组每例抽取外周血3mL， EDTA抗凝，放置于-20℃冰箱备用。

　　1.2  主要试剂和仪器  DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；SSO?HLA分型试剂盒(英国Dynal公司)；2400型PCR仪(美国PE公司)；双槽恒温水浴摇床(美国Robbins Scientific公司)；台式低温高速离心机(德国Heraeus公司)；UV754型紫外分光光度计(上海精密仪器有限公司)。

　　1.3  方法

　　1.3.1  基因组DNA的提取  采用德国QIAGEN公司DNA提取试剂盒，从研究对象的病例组和正常对照组全血中提取基因组DNA，按说明书操作。用紫外分光光度计测定DNA溶液纯度，当A260/A280值在1.6-1.8时，表明DNA纯度较高，放置于-20℃冰箱备用。

　　1.3.2  等位基因HLA?A、B分型  采用PCR?SSO方法，用英国Dynal RELITMSSO?HLA分型试剂盒。分别用不同引物扩增具有高度多态性的HLA?A、B位点第二、第三外显子，将扩增产物变性，使其成为单链，加到含有序列特异性寡核苷酸探针的尼龙薄膜上，使生物素标记的扩增产物与膜上探针结合，通过与亲和素?辣根过氧化物酶反应，用H2O2和四甲基联苯胺显色，记录探针杂交情况，通过分析软件Dynal Biotech PMP v5.40得出该样本HLA基因型别。

　　1.4  统计学分析  采用四格表卡方检验，用SPSS11.0统计软件进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。相对危险性(relative risk, RR)按Woolf公式。当RR显著性确定后，为明确表示相关等位基因对疾病的作用，进一步计算病因分数(etiologic fraction, EF)(RR>1)和预防分数(preventive fraction, PF)(RR<1)。

　　2  结果

　　2.1  等位基因HLA?A基因频率比较  HLA?A共出现15个位点，基因频率见表1。在48例正常对照组HLA?A等位基因中，A02、A11、A24、A33等位基因频率较高；A01、A23、A25、A29、A32等位基因频率较低。在65例白血病患者HLA?A等位基因中，A01、A02、A11、A24等位基因频率较高；A25、A29、A32、A34、A68等位基因频率较低。其中A01等位基因频率明显高于正常对照组(P<0.05)，A11等位基因频率明显低于正常对照组(P<0.05)，其他差异无统计学意义。

　　2.2  等位基因HLA?B基因频率比较  HLA?B共出现28个位点，各个基因分布比较分散，基因频率见表2。在48例正常对照组HLA?B等位基因中，B15、B40、B46等位基因频率较高；B07、B14、B38、B49、B50、B57、B67等位基因未出现。在65例白血病患者HLA?B等位基因中，B15、B38、B40、B46、B51、B58等位基因频率较高；B53、B54等位基因未出现。其中B38等位基因频率明显高于正常对照组(P<0.05)，其他无统计学意义。

　　表1  白血病与正常对照HLA?A等位基因频率分布（略）

　　Table 1  The distribution of HLA?A allele gene frequencies in patients and normal controls

　　*P<0.05 vs. control; RR of A01 gene in patients and controls=8.78; RR of A11 gene in patients and controls=0.32; EF of A01 gene in patients and controls=0.075; PF of A11 gene in patients and controls=0.64

　　表2  白血病与正常对照HLA?B等位基因频率分布（略）

　　Table 2  The distribution of HLA?B allele gene frequencies in patients and normal controls

　　*P<0.05 vs. control; RR of B38 gene in patients and controls=13.39; EF of B38 gene in patients and controls=0.057

　　3  讨论
   
　　HLA系统定位于第6号染色体短臂(6p21.3)，是人体内最复杂的遗传多态性系统。HLA等位基因多态性影响免疫应答和抗原呈递，并与某些疾病的易感性密切相关，是研究疾病易感性最不可忽视的遗传因素[3]。自20世纪60年代HLA与疾病相关性研究以来，涉及疾病已达数百种，特别是HLA?I类和II类分子，在移植免疫学及疾病发病机制上起着重要作用。
   
　　国内外已报道的有关HLA等位基因或抗原与白血病的相关性研究，由于人种、地域、样本大小及研究方法不同，所得的研究结果也各不相同。综合分析[4?8]得知，在慢性粒细胞白血病中，HLA?A32、B27、B44、B54、B55频率较正常人群显著增加，是危险性标志，而HLA?A11频率显著减少，是保护性标志。对于急性淋巴细胞白血病与HLA的关联性研究，发现对急性淋巴细胞白血病有遗传易感作用的基因有HLA?A01、A02、A24、B5、B15、B27、B40、B48、B56、B67；有遗传拮抗作用的有HLA?B58。本研究结果中，等位基因A01、B38对白血病具有易感性，是白血病发生中的危险标志，而A11则对白血病发生具有保护作用，与上述研究结果基本一致。
   
　　白血病是一种多基因遗传易感性疾病。在有多个易感位点的情形下，不同位点在不同人群中占优势，进而产生与相同疾病关联的多样性。研究结果不一致可能有以下几个方面的原因：①所采用的HLA分型方法不同。因为不同分型方法对HLA等位基因具有不同的分辨率。以往研究所采用的血清学分型方法存在某些方面的缺点如抗原之间的交叉反应性，分型血清难获得且受患者血象的限制等，因此结果分辨率低。本研究采用的PCR?SSO技术是目前最先进的基因分型技术，简单、实用、快速、特别是在常规血清学方法不能检出的HLA?II类抗原中，具有重要的应用价值。②所选样本来源于不同的人群。因为HLA基因频率分布与种族、地域等有关，不同种族、地域的人群HLA基因频率分布是不同的，从而造成一些偏移[9]。③疾病的不同类型也影响HLA基因分布。④所选样本量太少，由抽样误差造成的。
   
　　HLA复合体是一组紧密连锁的基因群，在同一染色体上很少发生交换，呈单倍型遗传方式。许多疾病的发生与HLA基因多态性有关，而且HLA分子的表达水平也与肿瘤免疫密切相关。开展对白血病患者HLA位点的多态性研究，对白血病的发病机制、早期诊断、预后及造血干细胞移植等研究都具有重要意义。本文研究结果为进一步探寻白血病的易感基因提供了线索。随着主要组织相容性复合体(MHC)区域全序列测序工作的完成，HLA分子的空间构象越来越受到重视，通过模拟，可以推测HLA构象多态性与白血病的相关性，这将有待于更大样本量和更为深入的研究。

基金项目：甘肃省基金暨中青年基金资助项目(No.YS001?A23?020)

【文献】
  　　[1]Gidal B, Spencer N, Maly M, et al. Valproate?mediated disturbances of hemostasis: relationship to dose and plasma concentration [J]. Neurology, 1994, 44(11):1418?1422.

　　[2]Ward MM, Barbaro NM, Laxer KD, et al. Preoperative valproate administration does not increase blood loss during temporal lobectomy [J]. Epilepsia, 1996, 37(1):98?101.

　　[3]Nepom GT, Erlich H. MHC class II molecules and autoimmunity [J]. Ann Rev Immunol, 1991, 9(5):493?525.

　　[4]高素青,邓志辉,金士正,等. 南方汉族急性淋巴细胞白血病与HLA基因相关性研究 [J]. 中国实验血液学杂志, 2005, 13(2):210?214.

　　[5]周丹,邹红岩,金士正,等. 南方汉族人群白血病患者与HLA等位基因相关性的研究 [J]. 江西医学检验, 2005, 23(4):316?319.

　　[6]梁晓岚,杨丛林,万长春,等. HLA基因与成人急性淋巴细胞白血病的相关性研究 [J]. 白血病淋巴瘤, 2004, 13(1):17?19.

　　[7]戴云鹏,阎文英,沈柏均,等. 儿童急性淋巴细胞白血病患者HLA?A,B,DRB1等位基因多态性研究 [J]. 中国优生与遗传杂志, 2003, 11(1):25?29.

　　[8]曹孟德，秦车春，岳保红，等. HLA?DRB1基因多态性与河南汉族人群急性淋巴细胞白血病关联分析 [J]. 河南医科大学学报, 2000, 35(1):46?48.

　　[9]Marsh SGE, Albert ED, Bodmer WF, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2004 [J]. Tissue Antigens, 2005, 65(5):301?369.