肝细胞癌中细胞凋亡相关基因的筛选

【摘要】  目的 探讨糖尿病大鼠主动脉中转化生长因子-β1（TGF-β1）表达及其抑制剂对其表达的影响。方法 链脲左菌素糖尿病大鼠随机分为对照组、联合干预组、维生素E组、氯沙坦组、氨基胍组。对照组用5 ml蒸馏水每日1次性灌胃，联合干预组用Vitamin E 10 mg/（kg·d），Losartan 10 mg/（kg·d），AG 50 mg/（kg·d），蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃，其他组按同样的方法分别处理，共饲养12周。免疫组化法检测TGF-β1的表达。结果 对照组TGF-β1高表达，联合用药组可见TGF-β1表达，两者有显著差异（P<0.01）。3个单味用药组之间差异无显著性，但其TGF-β1表达均高于联合用药组（P<0.05）,而低于对照组（P<0.05）。结论 STZ糖尿病大鼠主动脉组织中TGF-β1有高表达，一些药物能抑制TGF-β1这种表达，且联合用药优势明显。多途径干预TGF-β1可能延缓大血管病变形成。

【关键词】  转化生长因子-β1 干预 实验性糖尿病 血管病变

    Effect of combining interference on TGF-β1 in arteriae maxima Galeni of diabetic rat

     ［Abstract］  Objective  To study the expression of transforming growth factor-beta1 （TGF-β1） in the arteriae maxima Galeni of streptozotocin（STZ）-induced diabetic rat,and the influence of the inhibitors of TGF-β1 on the mRNA expression.Methods  Diabetic rats were divided randomly into 5 groups,which were contrast,combine interference,Vitamin E,Losartan and Aminoguanidine （AG）group.The interference group was taken orally once a day with 5 ml solution which consisted of  Vitamin E 10 mg/（kg·d），Losartan 10 mg/（kg·d）and AG 50 mg/（kg·d）.Contrast group was taken 5 ml distilled water.Other groups were taken respectively Losartan or Aminoguanidine （AG）.The time was 12 weeks.The mRNA expression of TGF-β1 was examined by immunohistochemistry.Results  TGF-β1 expressed obviously in contrast group,which had evident difference compared with  combine’s group（P<0.01）.There was no evident difference among the other 3 groups,but their expression of TGF-β1 was higher than combine group （P<0.05），but lower than contrast group（P<0.05）.Conclusion  TGF-β1 expresses highly in the arteria maxima Galeni of streptozotocin（STZ）-induced diabetic rat.It can restrain the expression by taking Angiotensin enzyme receptor  inhibitor,PKC inhibition and AGEs inhibition,and the expression can be enhanced by unitedly using these medicine.Combining interference on TGF-β1 can delay the vascular complications.

    ［Key words］  transforming growth factor-beta1；interference；experimental diabetes;vascular complications

    转化生长因子-β（TGF-β）是细胞外基质（ECM）及纤维细胞的有效诱导剂，与糖尿病血管病变有关。在糖尿病大鼠中，多途径联合用药阻断TGF-β的产生，从而抑制TGF-β对细胞外基质（ECM）及纤维细胞的有效诱导作用。激活TGF-β是多途径的，其可能途径有：（1）多元醇-蛋白激酶C（PKC）-TGF-β；（2）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）-PKC-TGF-β；（3）Amadori产物、AGEs-TGF-β；（4）多种生长因子 → TGF-β。笔者采用PKC抑制剂维生素E，AgnⅡ受体抑制剂Losartan，AGEs （糖基化终末产物）抑制剂氨基胍联合与单独干预链脲左菌素糖尿病大鼠，探究多途径用药对TBF-β1在糖尿病大鼠主动脉中TGF-β1 rnRNA表达的影响。现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  雄性成年Wistar大鼠60只，体重（195±10）g，由南华大学实验动物部提供。

    1.1.2  试剂  链脲佐菌素（streptozotosin,STZ）购自Sigma公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体购子自Santa Cruy公司；DAB显色剂和免疫组化SABC试剂盒购自博士得公司。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组  将糖尿病大鼠随机分为对照组（contrast），联合饲养组（combine），维生素E组，氯沙坦组（Losarean）和氨基胍组（AG组），共5组，每组10只。

    1.2.2  动物模型制作  用0.1 mol/L，pH 4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液把STZ配成5%的溶液，按65 mg/kg BW单次腹腔内注射（对照组注射0.25 ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液），48 h后用尾静脉采血测血糖，连续3天，血糖≥16.7 mmol/L者即为糖尿病鼠。

    1.2.3  方法  给药contrast组每日1次蒸馏水5 ml灌胃，combine组、Vitamin E组每日维生素E 6 mg/kg，蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃，Losartan组每日氯沙坦10 mg/kg，蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃；AG组给氨基胍每日50 mg/kg灌服方法同前。

    1.2.4  标本收集  结束时，断颈法处死大鼠10 min内取出整条主动脉，分离血管外组织，PBS清洗血管腔，置于液氮中备用。

    1.2.5  免疫组化检测  主动脉起始部上2～3 cm取材，石蜡包埋切片，用链亲和素-生物素-过氧化酶法（SABC法）检测TGF-β1，用PBS代替一抗作为阴性对照，DAB染色，苏木精复染。双盲法高倍镜观测。每切片从血管内向外，由上而下随机取10个视野（×400），记数DAB染色的点数，取均值表示TGF-β1的表达程度。

    1.3  统计学方法  数据用均数±标准差，方差分析组间差异性，直线回归分析相关性。

    2  结果

    正常对照组TGF-β1高表达，联合用药组可见TGF-β1表达，两者有显著差异（P<0.01）。4个单味用药组之间无显著差异，但它们的TGF-β1表达均高于联合用药组（P<0.05）,而低于未用药组（P<0.05）。见表1。表1  TGF-β1  在主动脉血管间质中的表达

    3  讨论

    由于TGF-β是细胞外基质（ECM）及纤维细胞的有效诱导剂，通过大量的细胞培养、动物实验和人体研究证实，TGF-β1在产生糖尿病诸多并发症中都起重大作用。尤其对糖尿病肾病，国内外做了大量研究，认为高血糖促进肾多种细胞合成和分泌转移生长因子-β（TGF-β）,并合成其Ⅰ、Ⅱ型受体,TGF-β在糖尿病肾病（DN）的发生中起着重要作用,它能直接导致肾多种细胞肥大、细胞外基质过度积聚,从而导致DN的特征性病理改变、联合使用多种方法直接或间接阻断TGF-β的作用已成为目前DN的一个研究热点［1］。

    除了糖尿病肾病外，糖尿病其他并发症的发生发展与TGF-β1的关系密切。研究发现糖尿病视网膜病变（DR）患者血浆TGF-β1水平升高,并且血浆TGF-β1水平可能与糖尿病视网膜病变的发生和发展有关［2］。在糖尿病大鼠肺组织高糖环境下,PKC被激活导致TGF-β1表达增高,引起细胞外基质（ECM）合成降解失调,可能参与了糖尿病肺部并发症的发生及发展［3］。陶冶等［4］分别用含不同浓度葡萄糖、分别加肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和胰岛素的10%小牛血清培养糖尿病大鼠主动脉血管内皮细胞，结果高糖环境下血管内皮细胞分泌的总TGF-β1及活性TGF-β1含量与对照组相比明显增加。认为TGF-β可能参与了糖尿病大血管并发症的发生发展。

    目前药物对TGF-β1的干预方面的研究成为热点。实验室研究和临床观察发现醛糖还原酶抑制剂（ARI）、糖基化终末产物（AGEs）抑制剂、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体抑制剂、蛋白激酶C（PKC）抑制剂以及活血化瘀中药等都分别对糖尿病慢性血管病变有阻遏作用。本试验发现，正常对照组TGF-β1高表达，联合用药组可见TGF-β1表达，但两者有显著差异（P<0.01）。4个单味用药组之间无显著差异，但它们的TGF-β1表达均高于联合用药组（P<0.05）,而低于未用药组（P<0.05），提示在糖尿病血管并发症发生中，可能是多种途径激活TGF-β1，从而诱导血管外基质和纤维细胞增生，多途径早期联合干预TGF-β的表达，能更好地阻抑糖尿病的各种血管并发症。

【】
  1 郭志新，邱明才.转化生长因子与糖尿病肾病关系的研究进展.实用医学杂志，2005，21（1）：100-102.

2 徐静，高燕凤，张春红，等.血浆TGFβ1水平与糖尿病视网膜病变关系的研究.医刊，2004，39（11） ： 26-27.

3 张静萍，杨光，吕品，等.Ⅳ型胶原酶在糖尿病大鼠肺组织表达及PKC活性变化的研究.中国医学杂志，2003，13 （18 ）：24-28.

4 陶冶，刘小菁，强鸥.高糖环境对体外培养糖尿病大鼠大血管内皮细胞产生转化生长因子-β的影响.华西医科大学学报，2001，32（1）：63-65.