淋球菌不同耐药水平中mtrF基因的表达
作者：王冬梅，夏忠弟，邹明祥，齐素文
【摘要】 目的 探讨mtrF基因在多重耐药淋球菌中的表达及其与高水平多重耐药淋球菌的关系。方法 ①纸片扩散法检测58株淋球菌对5种抗生素的敏感性；②试管稀释法测定淋球菌对红霉素的最小抑菌浓度(MIC)；③采用RT?PCR技术测定敏感组、低?中等水平多重耐药组及高水平多重耐药组中mtrD、mtrF基因的表达。结果 ①58株淋球菌中对2种或者2种以上抗生素耐药的有30株，占待测淋球菌的51.7%；②红霉素MIC为敏感、中介、耐药，分别为7株、21株和30株，有17株MIC值≥32.0μg/mL；③高水平多重耐药组mtrF基因表达量升高，与低?中等水平耐药组和敏感组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；但后两者之间无明显差异。耐药组mtrD基因表达量升高，与敏感组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；但两个耐药组之间无明显差异。结论 mtrF基因在高水平多重耐药组中表达均高于敏感组和低?中等水平多重耐药组，表明其在介导淋球菌产生高水平多重耐药过程中可能发挥着十分重要的作用。
【关键词】 淋病奈瑟菌；多重耐药；mtrF
MtrF gene expression in Neisseria gonorrhoeae of different resistance levels
ABSTRACT: Objective To study the relationship between the expression of mtrF gene and high?level multiple resistant Neisseria gonorrhoea. Methods ① The susceptibility of 58 clinical Neisseria gonorrhoeae to 5 kinds of antibiotic agents was tested by disc diffusion method. ② The minimum inhibitory concentration (MIC) of erythromycin was determined by tube dilution method. ③ The expression of mtrD and mtrF gene in susceptive group, inter?mediated resistant group and high?level multiple resistant group was detected by semi?quantitative RT?PCR. Results ① There were 30 strains presenting resistance to two or more than two antimicrobial agents, which accounted for 51.7% of the 58 clinical strains. ② The number of strains sensitive, intermediate and resistant to erythromycin was 7, 21 and 30, respectively, and there were 17 strains with erythromycin MIC≥32.0μg /mL. ③ Compared with that in susceptive group and inter?mediated resistant group, mtrF expression was up?regulated in high?level multiple resistant group (P<0.01). The mtrF expression had no significant change in susceptive group or inter?mediated resistant group. Compared with that in susceptive group, mtrD expression was up?regulated in two resistant groups (P<0.01). The mtrD expression had no significant change in high?level multiple resistant group or inter?mediated resistant group. Conclusion The mtrF expression is higher in high?level multiple resistant group than in other two groups, and mtrF gene may play an important role in mediating high?level multiple resistance in Neisseria gonorrhoeae.
KEY WORDS: Neisseria gonorrhoeae; multiple resistance; mtrF
近年来淋球菌多重耐药现象日益严重，并呈现出由低水平向高水平耐药的趋势。新近发现的mtrF基因在介导淋球菌产生高水平多重耐药中可能发挥着十分重要的作用。在本研究中我们主要探讨mtrF基因在多重耐药淋球菌中的表达及其与高水平多重耐药淋球菌的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 58株临床分离菌来自中南大学湘雅检验科，淋球菌药敏质控菌株ATCC49226和野生型淋球菌标准株ATCC19424为香港中文大学医学院微生物系惠赠。所有菌株均经形态学检查、氧化酶试验和糖发酵试验鉴定，以脱脂牛奶-70℃保存。
1.1.2 主要试剂 GC培养基和T?M培养基购自英国OXOID公司，药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，基因扩增引物由大连宝生物公司合成，pfu高保真酶、dNTP购自上海生物工程技术服务公司，DEPC、TRIzol试剂盒和cDNA逆转录试剂盒购自BBI公司，DNase(RNase free)购自大连宝生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养 取可疑淋病患者泌尿生殖道分泌物后，立即接种T?M培养基，37℃、5%(体积分数)CO2条件下培养24-48h后，经形态学检查、氧化酶试验、糖发酵试验鉴定。将纯菌转种于GC培养基1-2次传代后，洗入脱脂牛奶保存于-70℃冰箱中备用。
1.2.2 药敏试验 对红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、壮观霉素、头孢美唑的敏感性试验采用K?B法；通过琼脂糖稀释法测定红霉素的最小抑菌浓度(MIC)，并按美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准判断结果[1]。
1.2.3 总RNA抽提 采用TRIzol试剂盒(BBI公司)提取细菌总RNA，经无RNA酶DNase I消化可能残留的DNA，用10g/L的琼脂糖凝胶观察质量和紫外分光光度计测浓度后，分装-70℃保存。
1.2.4 半定量RT?PCR 取2μg总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，将总RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，以rmp基因为内对照进行PCR扩增。反应参数为95℃预变性5min，95℃变性60s，按表1温度退火45s，72℃延伸60s；32个循环后72℃延伸10min。所用引物序列见表1。不加cDNA模板为阴性对照。取6μL PCR产物点样于15g/L琼脂糖凝胶上(含EB)电泳，并在图像分析仪上进行吸光度扫描分析，以mtrD、mtrF基因扩增条带与rmp基因扩增条带的扫描峰面积比表示mtrD、mtrF基因表达水平的相对含量。
1.3 统计学处理 实验结果以均数±标准差(±s)表示，均数差异的显著性检验用方差分析，应用SPSS11.5 for Windows统计软件在机上完成。
表1 RT?PCR引物序列（略）
Table 1 Primer sequence of RT?PCR
2 结果
2.1 K?B法药敏试验结果 58株临床分离菌中同时对2种、3种、4种和5种抗生素耐受的菌株分别为19株、7株、2株和2株，多重耐药株占待测淋球菌的51.7%。
2.2 红霉素MIC检测结果 58株淋球菌MIC为0.064-128.0μg /mL，敏感、中介、耐药分别为7株、21株和30株，其中在耐药株中有17株为高度耐受。
2.3 RNA抽提结果 提取的总RNA经无RNA酶的DNase Ⅰ消化残留的DNA后，用紫外分光光度计测其A值，总RNA A260/A280比值为1.8-2.0，表明所提RNA纯度较高；从10g/L琼脂糖凝胶电泳图上可清晰看到23S 、16S两条带，表明RNA带完整，没有降解，可作为逆转录反应的模板(图1)。
图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳结果（略）
Fig.1 RNA elecrtophoresis
M: marker; Lane 1: ATCC19424; Lane 2: inter?mediated resistant strain; Lane 3: high?level multiple resistant strain
2.4 RT?PCR扩增结果 根据红霉素MIC的不同，结合K?B法检测结果，将58株临床菌按条件分为敏感组(对5种抗生素均敏感的5株菌和标准株ATCC19424)、低?中等水平多重耐药组(红霉素MIC介于8.0-32.0μg/mL，对2种或2种以上抗生素耐受的8株菌)和高水平多重耐药组(红霉素MIC≥32.0μg/mL，对2种或2种以上抗生素耐受的13株菌)3个组。RT?PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后采用Phar Bio扫描、摄像，并运用Image Master VDS software曲线下各峰下面积及其比值。
2.4.1 mtrF基因的表达 mtrF基因在高水平多重耐药组表达量升高(1.019±0.161)，与敏感组(0.595±0.064)比较差异有统计学意义(P<0.01，图2)；低?中等水平耐药组(0.671±0.073)和敏感组mtrF基因的表达量无明显差异(图3)。
图2 敏感组与高水平多重耐药组mtrF基因的表达水平（略）
Fig.2 Expression of mtrF gene in susceptive group and high?level multiple resistant group
M: marker; Lane 1-2: susceptive group; Lanes 3-6: high?level multiple resistant group; Lane 7: negative control
图3 敏感组与低?中等水平耐药组mtrF基因的表达水平（略）
Fig.3 Expression of mtrF gene in susceptive group and inter?mediated resistant group
Lane 1: negative control; Lanes 2-3: inter?mediated resistant group; Lanes 4-5: susceptive group; M: marker
2.4.2 mtrD基因的表达 mtrD基因在高水平多重耐药组表达量升高(0.873±0.056)，与敏感组(0.525±0.060)比较差异有统计学意义(P<0.01，图4)；mtrD基因在低?中等水平耐药组表达量升高(0.811±0.055)，与敏感组比较差异也有统计学意义(P<0.01，图5)。
图4 敏感组与高水平多重耐药组mtrD基因的表达水平（略）
Fig.4 Expression of mtrD gene in susceptive group and high?level multiple resistant group
M: marker; Lanes 1-2: susceptive group; Lanes 3-6: high?level multiple resistant group; Lanes 7: negative control
图5 敏感组与低?中等水平耐药组mtrD基因的表达水平（略）
Fig.5 Expression of mtrD gene in susceptive group and inter?mediated resistant group
M: marker; Lanes 1-2: inter?mediated resistant group; Lanes 3-5: susceptive group; Lanes 6: negative control
3 讨论
淋球菌产生耐药的原因除由质粒介导产生的β?内酰胺酶外，主要是由染色体控制通过膜蛋白机制及膜通透性改变而产生耐药性[2]。1973年Maness等[3]提出淋球菌染色体上存在的mtr系统，它调节着淋球菌对脂溶性因子(hydrophobic agents, HAS)的敏感性，其中包括疏水性抗生素、胆盐、脂肪酸、中性洗涤剂和性腺甾族的激素。该系统的位点突变可引起淋球菌对疏水性抗生素非特异性的低水平耐药，同时可提高对某些染料去污剂的抵抗力。mtr系统是能量依赖的细胞膜外排泵，由mtrR调控基因、mtrCDE结构基因组成的一个操纵子调控的。新近研究发现，在mtrR基因下游的22bp处有一个与mtrRCDE外排泵关系密切被命名为mtrF的新基因，参与淋球菌高水平耐药。拓扑结构显示mtrF是由1.6kb编码，分子质量约为56.1ku，含有12个跨膜区的细胞内膜蛋白[4]。MtrF并不属于mtrCDE外排泵的核心成份，并且MtrF自身也不能介导淋球菌对HAS耐受；但在具有mtr表型的淋球菌，MtrF在介导其对HAS的高水平耐受中起着十分关键的作用[5]。国内尚无相关报道。本研究通过RT?PCR检测mtrF基因的表达情况，同时测定mtrD基因的表达量以探讨MtrF蛋白是否参与淋球菌高水平多重耐药以及其与mtrRCDE外排泵的关系。
本研究通过K?B法检测了58株淋球菌对5种抗生素的敏感性，同时采用琼脂糖稀释法测定了红霉素MIC。红霉素早已不作为淋病的药物，但在国际上红霉素和TritonX?100可以作为衡量淋球菌多重耐药的指标。研究发现一群具有mtr表型的淋球菌，对红霉素及阿奇霉素敏感性降低或产生耐药，而对TritonX?100仍然敏感。提示TritonX?100作为筛选多重耐药株的指标，可能会漏掉类似此型的菌株[6]。因此，本研究选用红霉素而不是常规的TritonX?100作为筛选多重耐药淋球菌的指标，从58株临床分离菌中筛选出了5株敏感菌、8株低?中等水平多重耐药株和13株高水平多重耐药株。通过RT?PCR检测3个组中mtrD基因和mtrF基因的表达情况。结果分析显示，高水平多重耐药组mtrF基因表达量升高，与中等水平耐药组和敏感组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；但后两者之间无明显差异。耐药组 mtrD基因表达量升高，与敏感组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；但两个耐药组之间无明显差异。这些结果表明：mtrF基因只在高水平多重耐药株中表达上调，MtrF蛋白可能参与介导淋球菌高水平多重耐药，并发挥着十分重要的作用；低?中等水平多重耐药株和高水平多重耐药株中的mtrD基因表达均升高，即MtrF蛋白起作用的前提是淋球菌mtrCDE外排泵系统发挥作用，而产生基础水平多重耐药的淋球菌株中时并不一定需要MtrF蛋白的参与。推测这种作用可能是MtrF作为mtrCDE外排系统的辅助因子，维持了外排泵结构的稳定性；也可能是在具有耐药表型并表达mtr外排泵的耐药株置于高浓度HAS环境时，MtrF将外排泵所需的ATP能量或者是将过多的HAS运输给外排泵，起着重要的运输和传承功能。
基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目(No. B2003?041)；河南科技大学科研基金资助项目(No.13530021)
【】
[1]No authors listed. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twelfth informational supplement [R]. NCCLS document M100?S12, Pennsylvania, NCCLS, 2002:100?133.
[2]Pan W, Spratt BG. Regulation of the permeability of the gonococal cell envelope by the mtr system [J]. Mol Microbiol, 1994, 11(4):769?775.
[3]Maness MJ, Sparling PF. Multiple antibiotic resistances due to a single mutation in Neisseria gonorrhoeae [J]. J Infect Dis, 1973, 128(3):321?330.
[4]Veal WL, Shafer WM. Identification of a cell envelope protein (mtrF) involved in hydrophobic antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae [J]. J Antimicrob Chemother, 2003,51(1):27?37.
[5]Folster JP, Shafer WM. Regulation of mtrF expression in Neisseria gonorrhoeae and its role in high?level antimicrobial resistance [J]. J Bacteriol, 2005, 187(11):3713?3720.
[6]Zarantonelli L, Borthagaray G, Lee EH, et al. Decreased susceptibility to azithromycin and erythromycin mediated by a novel mtrR promoter mutation in Neisseria gonorrhoeae [J]. J Antimicrob Chemother, 2001, 47(5):651?654.
