益肾胶囊对系膜增殖性肾小球肾炎大鼠肾脏NF?κB及PDGF?β表达的影响
作者：吴喜利，孙万森，张王刚，乔成林，马巧亚
【摘要】 目的 探讨益肾胶囊对系膜增殖性肾小球肾炎(MsPGN)大鼠肾脏核转录因子(NF?κB)及血小板源生长因子β(PDGF?β)表达的影响。方法 观察组大鼠血脂、肾功能及24h尿蛋白(Pro/24h)的变化，同时用SABC免疫组化方法检测各组肾小球、肾小管NF?κB及PDGF?β的表达情况。结果 经过8周的观察，治疗组大鼠血脂、肾功能及Pro/24h与模型组比较，甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL?C)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及Pro/24h均明显降低(P<0.05或P<0.01)，而高密度脂蛋白(HDL?C)明显升高(P<0.05)；且益肾胶囊可明显抑制肾组织NF?κB、PDGF?β的表达(P<0.05或P<0.01)。结论 益肾胶囊可明显降低MsPGN大鼠血脂及Pro/24h，改善肾功能，其作用机制可能与抑制肾组织NF?κB、PDGF?β的表达有关。
【关键词】 益肾胶囊；系膜增殖性肾小球肾炎；核转录因子；血小板源生长因子?β
Effects of Yishen Capsule on the expression of NF?κB and PDGF?β in renal tissues of rats with mesangial proliferative glomerulonephritis
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of Yishen Capsule on the expression of NF?κB and PDGF?β in renal tissues of rats with mesangial proliferative glomerulonephritis. Methods We observed the change of blood?lipid, renal function and proteinuria/24h of rats with mesangial proliferative glomerulonephritis in treatment group. At the same time, protein expressions of NF?κB and PDGF?β in kidney were measured by immunohistochemistry. Results After six weeks? treatment, compared with those in model group, serum triglyceride, total cholesterol, low?density lipoprotein, blood creatinine, blood urea nitrogen and proteinuria /24h were lowered obviously in treatment group (P<0.05 or P<0.01). The expression of NF?κB and PDGF?β was inhibited by Yishen Capsule (P<0.05 or P<0.01). Conclusion Yishen Capsule can lower blood?lipid and proteinuria/24h and improve the renal function of mesangial proliferative glomerulonephritis in rats. The machanism may have relation with inhibiting the expression of NF?κB and PDGF?β in renal tissues.
KEY WORDS: Yishen Capsule; mesangial proliferative glomerulonephritis; NF?κB; PDGF?β
益肾胶囊是我们根据多年的临床经验制成的治疗慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis, CGN)的囊性制剂，既往我们在临床研究中观察到益肾胶囊具有明显降低慢性肾炎患者尿蛋白，提高患者免疫功能等作用[1?2]。近期，我们通过实验研究观察了该方药对系膜增殖性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)大鼠肾脏核转录因子(nuclear factor kappa B, NF?κB)及血小板源生长因子β(platelet?derived growth factor beta, PDGF?β)表达的影响，以进一步探讨益肾胶囊治疗慢性肾小球肾炎的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康纯种雄性SD大鼠60只，体重(120±20)g，由西安大学医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂与药品 免疫组化试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司(Boster)，试剂全部采用即用型SABC试剂盒，产品编号为SA1022；益肾胶囊由西安交通大学医学院第二附属制剂室提供，陕药制字[2001]第1424号，由黄芪、党参、熟地、山芋、山药、仙鹤草、茯苓、泽泻、潼蒺藜等组成，加水制成1mL含生药1.25g的药液，冰箱保存备用。
1.3 大鼠模型的建立与分组 全部SD大鼠预养1周后，随机将其分为对照组、模型组和治疗组，每组各20只。其中模型组和治疗组大鼠分别经尾静脉注射抗大鼠胸腺细胞免疫血清(anti?thymocyte serum, ATS)10.0mL/kg体重，制作系膜增殖性肾小球肾炎模型[3]。治疗组按每公斤体重3.75g生药，灌服益肾胶囊稀释液；对照组则给予同等量的自来水灌服；每日1次，连续给药8周。
1.4 生化指标的检测 于第8周末大鼠处死前由股静脉采血，冷却、离心，取血清作肾功能、血脂等指标的测定。
1.5 24h尿蛋白定量的测定 实验开始后的8周，用代谢笼收集24h尿液标本，应用美国生产的Miditron M型尿液自动分析仪进行检测。
1.6 标本采集与染色 全部动物于实验结束后逐个宰杀取肾脏，并反复用生理盐水灌洗后入10%(体积分数)的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片。然后，严格按SABC试剂盒要求进行免疫组化染色。NF?κB按推荐条件行微波抗原修复，PDGF?β不用抗原修复直接进入下一步。选(抗原表达最丰富的)对照组用PBS代替相应一抗作为阴性对照。
1.7 切片处理与原始数据的采集[4] 免疫组化染色阳性结果的判定标准是阳性组织呈棕黄色，阴性部分呈淡蓝色，分布于肾小球系膜细胞的细胞质、胞核、核膜及肾小管上皮细胞的细胞质等部位。用图像采集模块软件，每组切片随机采集30个视野(10-20倍物镜)，用组化分析模块软件对每个视野的肾小球和肾小管/间质进行阳性目标分割、视野调整(去除非组织视野所占空间等)后，得出每个肾小球和肾小管/间质视野阳性目标面密度(阳性染色面积/统计场面积)及阳性单位(代表染色部分的平均吸光度，染色越深，数值越大)，而阳性面密度与阳性单位之乘积可以反映免疫组化阳性目标的总强度，即抗原的总量。为保证测定数据的准确性，对每个统计场的参数进行3次操作，最后取3次参数的均值作为统计场参数进入统计学分析的原始数据。
1.8 统计学处理 所有数据均以±s表示，运用SPSS 10.0软件包进行统计分析，采用t检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 益肾胶囊对MsPGN大鼠血脂、肾功能及24h尿蛋白(Pro/24h)的影响 模型组及治疗组大鼠血脂、肾功能及Pro/24h与对照组比较，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；治疗组大鼠血脂、肾功能及Pro/24h与模型组比较，TG、TC、LDL?C、Scr、BUN及Pro/24h均明显降低(P<0.05或P<0.01)，而HDL?C明显升高(P<0.05，表1)。
表1 益肾胶囊对MsPGN大鼠血脂、肾功能及Pro/24h的影响（略）
Table 1 Effects of Yishen Capsule on blood?lipid, renal function and proteinuria /24h in MsPGN rats
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs. model group; Scr: serum creatinine; BUN: blood urea nitrogen; TG: triglyceride; TC: total cholesterol; HDL?C: high density lipoprotein cholesterol; LDL?C: low density lipoprotein cholesterol; Pro: proteinuria
2.2 免疫组化染色结果 整体免疫组化着色情况：在模型组染色强度及面积显著增强(P<0.05)，其中肾小管着色明显强于肾小球，尤其是近曲小管。阴性对照未见非特异性着色，说明整个免疫组化实验中未受内源性过氧化物酶及生物素的影响。治疗组的着色面积及阳性单位均明显低于模型组。NF?ΚB的着色情况：在对照组NF?κB的着色主要分布于肾小球系膜细胞、内皮细胞以及肾小管上皮细胞的细胞质中，着色强度微弱。模型组的着色强度及面积明显增强，且核内着色明显增多。治疗组的着色强度、面积均明显低于模型组并接近对照组(表2)。PDGF?β的着色情况：对照组可见着色主要集中在集合管、远端小管、近端小管细胞质中，肾小球系膜区表达极微量，模型组着色面积及强度明显增大。治疗组着色面积及强度较模型组明显减弱(表2)。
2.3 益肾胶囊对大鼠肾脏NF?κB及PDGF?β表达的影响 与对照组、治疗组比较，模型组NF?κB、PDGF?β的表达均明显增高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，治疗组NF?κB、PDGF?β的表达下降，具有统计学差异(P<0.05或P<0.01，表2)。
表2 益肾胶囊对MsPGN大鼠肾脏NF?κB及PDGF?β表达的影响（略）
Table 2 Effects of Yishen Capsule on the expression of NF?κB and PDGF?β in renal tissues of rats with MsPGN
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs. model group; NF?κB: nuclear factor kappa B; PDGF?β: platelet?derived growth factor beta
3 讨论
MsPGN是我国慢性肾炎中最常见的病理类型，据统计占我国肾穿刺的79.3%[5]。该病临床表现多样，如血尿、蛋白尿、肾病综合征、高血压、肾功能不全及肾小管间质损害等，其中以持续性血尿和蛋白尿为特征。它的主要病理变化是肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质增多。祖国医学认为MsPGN的发病原因是多方面的，其病程长，病症复杂，使其辨证分型很难统一。但临床上以阴虚、气虚为最多见，而阴虚、气虚与瘀血有着必然的联系。血的运行需津液的运载，水津充肺，血始能行，津亏不足以载血，血行涩滞易形成瘀血。且MsPGN常因外感起病，并进一步引起肺、脾、肾等脏腑功能失调，水液代谢障碍，湿浊俱下，或扰于下焦，致封藏失职，而成蛋白尿。可见本病虚实夹杂，本虚标实，脏腑功能失调与病邪稽留并存。根据以上分析，我们针对MsPGN的虚、浊、瘀等病理改变而立法组方制成囊性制剂益肾胶囊，来观察其对MsPGN大鼠血脂、24h尿蛋白定量、肾功能和肾组织NF?κB及PDGF?β表达的影响。方中六味地黄丸滋阴补肾；党参、黄芪益气扶正；潼蒺藜补肾益精，收涩固精；仙鹤草活血消肿；甘草和中解毒；诸药合用益气养阴，活血清利可兼顾其邪实，长期使用不伤正气。药研究认为六味地黄丸具有调节神经?内分泌?免疫调节的平衡，保护肝脏和调节肾脏功能等作用[6]；黄芪可增加抗体的产生和NK细胞的活性，诱导干扰素的产生及促进中性粒细胞趋化运动和淋巴细胞的转化，提高非特异免疫功能[7]；有研究还认为黄芪能降低全血比粘度、纤维蛋白原，抑制血小板的积聚，改善CGN患者的血液流变学[8]，改善全身及肾脏的血流动力学[9]，降低尿蛋白，通过T细胞介导增强患者的细胞免疫功能[10]，对CGN患者有较强的对证性和多环节的作用。近年的研究发现转录调节因子NF?κB对细胞内许多基因特别是免疫反应相关基因的表达起关键的调控作用。在肾脏的肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞和由血循环浸入的血液免疫细胞均存在NF?κB的转录调控。浸入肾脏的炎症细胞(中性白细胞、单核巨噬细胞)，肾小球的系膜细胞和肾小球脏层上皮细胞等可自分泌及旁分泌产生多种炎症介质(细胞因子、生物活性酯、蛋白酶、活性氧和细胞黏附分子等)作用于肾脏产生病理性效应。目前，研究已知NF?κB参与调控的因子如IL?1、IL?2a、IL?6、IL?8等与肾小球肾炎的进展有关[11]。在各种因子的相互影响和相互作用的复杂网络中，作为转录调节的核因子，NF?κB起着中心控制作用。MsPGN的细胞增生和免疫炎症反应都离不开各种细胞因子的异常表达，而NF?κB参与许多细胞因子的表达调控，在肾脏病的发病机制中起重要作用。蛋白尿、白蛋白尿[12]以及晚期糖化终产物[13]都可以引起肾脏固有细胞的NF?κB的异常活化，而通过肾小球滤过的白蛋白不仅堆积在系膜区促进系膜细胞增殖及胞外基质的积聚，更重要的是进入肾小管的白蛋白在增加近曲小管上皮细胞重吸收的同时会增加溶酶体活性引起细胞损伤。血小板源生长因子(platelet?derived growth factor, PDGF)是一种由血小板、巨噬细胞、平滑肌细胞及系膜细胞等产生的具有多种生物学效应的多肽类生长因子，具有多种生物学效应，参与组织器官多种生理活动。近年来动物及临床实验研究证明PDGF介导和调节了多种肾脏疾病的病理过程，在许多肾脏疾病的发生中发挥了重要作用。运用免疫组化等方法证实在人系膜增殖性肾小球肾炎中PDGF在肾小球中表达增加，PDGF?β的含量亦增加，且PDGF能促进肾小球系膜细胞以及肾小球壁层上皮细胞外基质的产生，并收缩肾小球毛细血管袢等[14?15]。值得注意的是肾小球滤过的白蛋白可改变肾小管细胞生物学活性，诱导表达多种细胞因子和细胞介质，其中PDGF?β是重要的一员。由此可见，炎症细胞因子与肾脏细胞、细胞因子与细胞因子间的相互作用，可以呈连锁、协同、放大等复杂的生物学效应，在肾小球肾炎进展中极为重要。本研究的结果显示：经过8周的观察，治疗组大鼠血脂、肾功能及24h尿蛋白与模型组比较，TG、TC、LDL?C、Scr、BUN及Pro/24h均明显降低(P<0.05或P<0.01)，而HDL?C明显升高(P<0.05)；且益肾胶囊可明显抑制肾组织NF?κB、PDGF?β的表达(P<0.05或P<0.01)。推断益肾胶囊治疗MsPGN大鼠的作用机制可能与抑制肾组织NF?κB、PDGF?β的表达有关。
基金项目：陕西省中医管理局资助项目(No.2003158).
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