DC?CIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用
【摘要】 目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后DC?CIK细胞的体外增殖能力、免疫表型变化、分泌细胞因子水平以及抗淋巴瘤细胞活性。方法 正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素?γ(IFN?γ)、白细胞介素?12(IL?12)的水平。结果 DC?CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05)；DC、CIK细胞共培养后，CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05)；共培养3d，DC?CIK细胞上清液中IL?12、INF?γ的分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01，P<0.05)；在5∶1-40∶1的效靶比范围内，DC?CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05)，且杀伤率与效靶比呈正相关。结论 DC?CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子水平、抗淋巴瘤细胞活性均高于CIK细胞，为DC?CIK细胞免疫提供了实验和理论依据。
【关键词】 CIK细胞；DC?CIK细胞；生物学活性；抗淋巴瘤
The biological activity and anti?tumor effect against lymphoma cells in DC?CIK cells
ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities, phenotype changes, level of secretory cytokines and anti?tumor activity against lymphoma cells of DC?CIK cells in co?culture of cytokine?induced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were co?cultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapan?blue staining, killing activity was detected by MTT assay, cells phenotypes were analyzed by flow cytometry, secretions of INF?γ and IL?12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DC?CIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P<0.05). Under the same condition, the ratio of CD3+ CD56+ and CD3+ CD8+ double positive cells in CIK cells was significantly enhanced by co?culture with DC (P<0.05). In DC?CIK cells, the level of IL?12 and INF?γ in culture supernatants was increased noticeably on day 3 compared to CIK cells which were cultured alone (P<0.01, P<0.05). At the effector?target ratio from 5∶1 to 40∶1, the anti?tumor effect of DC?CIK cells was much higher than that of CIK cells (P<0.05), and this effect was positively related with the effector?target ratio. Conclusion The proliferation activity, level of secretory cytokines, and anti?tumor effect against lymphoma cells of DC?CIK cells were significantly higher than those of CIK cells. The research provides theoretical and experimental basis for the immunotherapy of DC?CIK cells.
KEY WORDS: cytokine?induced killer cell; dendritic cells?cytokine induced killer cell; biological activity; anti?lymphoma
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine?induced killer cells, CIK)是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞[1]。树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原，并诱发细胞毒Ｔ淋巴细胞反应[2]。在本研究中，我们通过多种细胞因子组合从正常人外周血中诱导DC、CIK细胞，并将两者共培养，观察DC?CIK细胞体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平，旨在为其临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 rhIL?2、RPMI 1640培养基及四甲偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品，培养用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL?1、rhIFN?γ、rhTNF?α为上海生物制品研究所产品，rhGM?CSF为先灵葆雅公司惠赠，rhIL?4购自Gibco BRL公司，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及检测细胞因子(IL?12、IFN?γ)的ELISA试剂盒均购自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLA?DR和FITC兔抗鼠荧光二抗购自医学院天津血液学研究所。
1.2 靶细胞来源 Raji为人组织淋巴瘤细胞株，引自上海第二医科大学瑞金血液学研究所；新鲜淋巴瘤细胞取自外科手术切除的淋巴瘤标本(淋巴结或脾脏)，去除结缔组织和坏死组织，剪成1mm3的组织块，2.5g/L的胰酶消化后过100钢目，经淋巴细胞分离液分离，获得恶性淋巴瘤细胞(malignant lymphoma cells, MLC)，存于液氮中待用。要求靶细胞比例>95%，活体细胞>90%。
1.3 CIK细胞的培养扩增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以Ficoll?Hypaque淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，调细胞密度为4×106/mL；贴壁培养1-2h，收集悬浮细胞用含10%(体积分数)小牛血清(FSC)的RPMI 1640液调细胞密度为1×106/mL，第0天加入rhIFN?γ1000u/mL，放置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养24h后加入rhIL?2300u/mL、rhIL?1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，继续培养，以后每3d更换新鲜培养液，补加rhIL?2。
1.4 DC的体外培养 参照方法[3]。获得健康人外周血MNC中的贴壁细胞，用含10%(体积分数)FSC的RPMI 1640培养基培养，其中包含rhGM?CSF 550u/mL，rhIL?4500u/mL。隔日半量换液，补加细胞因子，收获前72h再加入rhTNF?α 50u/mL，诱导DC成熟。
1.5 DC?CIK细胞的培养 收获培养第9天的DC细胞及CIK细胞经活细胞计数后按1∶5混合培养，第3天和第6天，收集细胞做生物学活性测定。
1.6 细胞毒活性的测定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效应细胞和靶细胞放入96孔板，另设单独靶细胞及效应细胞孔，每孔设3个复孔，置37℃，5%(体积分数)CO2孵育箱中培养48h，按本室建立的MTT法[4]测杀伤活性。杀伤活性(%)=[1-(实验组A-效应组A)/靶细胞A]×100%。
1.7 细胞免疫表型的分析 用流式细胞仪检测CIK及DC?CIK细胞的免疫表型；间接免疫荧光法测定DC免疫表型。
1.8 细胞因子的检测 收集培养细胞上清液进行IL?12、IFN?γ水平测定。采用ELISA双抗夹心法，操作按试剂盒说明。
1.9 统计学处理 数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 增殖能力的观察 CIK细胞培养第6天进入显著增殖期，部分细胞体积明显增大,成丛或集落状悬浮生长。与DC共培养可明显提高CIK细胞增殖速率。培养第15天,经台盼蓝排斥法活细胞计数，CIK细胞总数扩增到原来的(43.57±5.11)倍，而DC?CIK细胞为(60.75±4.89)倍，两组差异有统计学意义(P<0.05，图1)。
图1 培养时间与增殖倍数的关系（略）
Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold
2.2 细胞表型的分析
2.2.1 DC的形态及表型检测 培养第9天的DC 细胞在倒置显微镜下可观察到典型的树状或毛刺状突起。检测细胞表面分子表达，其特异性标志CD1a的阳性率为(80.56±1.72)%，MHC?I类分子HLA?DR的阳性率为(92.06±3.20)%，CD14的表达率为(8.69±1.76)%。表明此种方法可以诱导较高纯度的成熟DC。
2.2.2 DC与CIK细胞共培养后的免疫表型 CIK细胞单独培养，随着培养时间的延长，CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞的比例逐渐增加。与DC共培养的CIK细胞CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞的比例明显高于同条件下未共培养组(P<0.05，表1)。
2.3 体外细胞毒性 共培养3d的DC?CIK细胞，对Raji细胞株及新鲜MLC的杀伤活性均明显高于单纯CIK细胞(P<0.05)，且对Raji和MLC杀伤率的影响无差异。在5∶1-40∶1的效靶比范围内，其杀伤作用与效靶比呈正相关(表2)。
表1 CIK和DC?CIK细胞免疫表型的变化（略）
Table 1 The phenotype changes of CIK and DC?CIK cells
*P<0.05 vs. the same condition CIK
表2 DC? CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性（略）
Table 2 Killing activity of DC?CIK cells on MLC and cell line Raji
2.4 细胞因子的测定 DC与CIK细胞共培养3d，其上清液中IFN?γ、IL?12的水平分别为(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同条件下，CIK细胞组IFN?γ为(213.96±137.00)ng/L，IL?12为(10.10±0.35)ng/L，两组相比，DC?CIK细胞分泌IFN?γ、IL?12的水平显著高于CIK细胞(P<0.05，P<0.01)。
3 讨论
CIK细胞是由多种细胞因子如IL?2、IFN?γ和CD3单克隆抗体等诱导的一种免疫活性细胞，其兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点[5]。DC摄取、加工、处理抗原，高表达MHC?I、MHC?Ⅱ类分子、共刺激分子及黏附分子，在体内外具有激发初次和继发性T细胞免疫应答功能，并能分泌Th1型细胞因子IL?12，诱导T细胞和NK细胞产生IFN?γ和增强激活NK细胞的细胞毒活性。为此，将具有高效杀瘤活性的CIK细胞和具有强大肿瘤抗原递呈能力的DC共培养，无疑会起到一定的抗肿瘤协同作用。研究发现DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强[6]。本实验显示DC、CIK细胞一起培养后，共培养物DC?CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用显著高于同条件下单纯CIK细胞。虽然与报道[6?7]有关DC?CIK细胞来源、制备方法、效靶比、效靶细胞作用时间以及靶细胞种类不尽相同，但DC?CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤活性与文献中DC?CIK细胞对胰腺癌细胞DAN?G及CML细胞的杀伤活性强于CIK细胞的结论相同。证实DC?CIK细胞确实具有比CIK细胞更强的抗肿瘤活性。CIK细胞属于异质细胞群，其抗肿瘤作用与CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞及分泌细胞因子的水平密切相关。将DC、CIK细胞一起培养后，两者所分泌的细胞因子及表面分子表达发生了变化。研究发现DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLA?DR的表达增加[8]。而CD4+CD25+细胞(调节细胞T细胞)和IL?10水平下降，对肿瘤细胞的细胞毒活性增强[9]。负载CA19?9(肿瘤相关抗原)的DC与CIK细胞混合培养24h后IL?12的分泌量为CIK细胞单独培养时6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK细胞分泌IFN?γ的时间延长，分泌量增加[10]。我们的实验显示，共培养条件下，DC?CIK细胞上清液中IL?12、IFN?γ分泌量均比同条件下单纯CIK细胞培养分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比例也比CIK细胞组显著增多。说明DC?CIK细胞的高杀伤活性与大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞有关，细胞因子IL?12、INF?γ对杀伤肿瘤也发挥了直接和间接的重要作用。DC能够激活CIK细胞增殖。与DC共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出两倍左右[7]。本研究结果表明，共培养DC?CIK细胞不仅具有很强的杀瘤活性，且比同源CIK细胞具有更强的增殖速率，共培养6d，DC?CIK细胞总数比单独培养CIK细胞总数多扩增了17倍。说明利用共培养条件可提高CIK细胞的增殖能力，获得大量高效的免疫细胞，这对于肿瘤临床具有重要意义。本研究初步证实，DC?CIK细胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于单纯CIK细胞，这为其临床应用或辅助治疗淋巴瘤提供了实验和理论依据。
基金项目：陕西省“三五人才工程”专项基金资助项目
【文献】
[1]Yamaguchi Y, Ohshita A, Kawabuchi Y, et al. Adoptive immunotherapy of cancer using activated autologous lymphocytes?current status and new strategies [J]. Hum Cell, 2003, 16(4):183?189.
[2]周昌菊，马薇，周建大,等. 自体宫颈癌?树突细胞疫苗激活的CTL杀伤效应 [J]. 癌症杂志, 2006, 25(2):143?147.
[3]Motta MR, Castellani S, Rizzi S, et al. Generation of dendritic cells from CD14+ monocytes positively selected by immunomagnetic adsorption for multiple myeloma patients enrolled in a clinical trial of anti?idiotype vaccination [J]. Br J Haematol, 2003,121(2):240?250.
[4]魏绪仓，邢佩霓，赵文理，等.人脐血CD3AK细胞生物学活性及抗瘤作用的实验研究 [J]. 西安大学学报(医学版), 2005, 26(1):52?85.
[5]Wang FS, Lin MX, Zhang B, et al. Antitumor activities of human autologous cytokine induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo [J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):464?468.
[6]Linn YC, Hui KM. Cytokine?induced killer cells: NK?like T cells with cytotolytic specificity against leukemia [J]. Leuk Lymphoma, 2003, 44(9):1457?1462.
[7]Marten A, Schottker B, Ziske C, et al. Increase of the immunostimulatory effect of dendritic cells by pulsing with CA19?9 protein [J]. J Immunother, 2000, 23(4):464?472.
[8]Hackstein H, Thomson AW. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs [J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(1):24?34.
[9]Schmidt J, Eisold S, Buchler MW, et al. Dendritic cells reduce number and function of CD4+CD25+ cells in cytokine?induced killer cells derived from patients with pancreatic carcinoma [J]. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53(11):1018?1026.
[10]FuJii S, Shimizu K, Kronenberg M, et al. prolonged IFN?gamma?producing NKT response induced with alpha?galactosylceramide?loaded DCs [J]. Nat Immunol, 2002, 3(9):867?874.
