碱性成纤维细胞因子在博莱霉素致肺纤维化肺血管损伤中的作用
作者：刘华，陈利萍，朱新菊，贺永锋，赵杰，刘新社
【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞因子(bFGF)在博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化肺组织中的表达及其在肺血管损伤中的作用。方法 于大鼠气管内注射BLM以复制其肺纤维化模型,应用bFGF多克隆抗体按SABC法行免疫组织化学染色,定量图像分析。结果 BLM组动物支气管上皮细胞胞浆内、支气管和肺小动脉肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内可见较多棕黄色细颗粒状bFGF阳性表达产物,显著高于对照组(P<0.05)。结论 在BLM致大鼠肺纤维化过程中bFGF表达上调，提示bFGF可能参与肺间质纤维化的发病过程。
【关键词】 碱性成纤维细胞因子；博莱霉素；肺纤维化；血管损害；免疫组化
The role of bFGF in vascular injury of BLM?induced pulmonary fibrosis
ABSTRACT: Objective To explore the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in pulmonary tissues of rats with bleomycin?induced pulmonary fibrosis and the role of bFGF in vascular injury. Methods Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin(BLM). Lung expression of bFGF proteins was assessed by SABC immunohistochemistry using bFGF monoclonal antibody and quantitative image analysis. Results The expression of bFGF in the lung tissues of BLM group was mainly distributed in bronchiole epithelial cells, muscular layers of bronchi and arterioles, and alveolar macrophage. It was higher than that in control group, with significant difference (P<0.05). Conclusion The up?regulation expression of bFGF in the BLM?induced pulmonary fibrosis indicates that it directly participates in the process of pulmonary fibrosis.
KEY WORDS: basic fibroblast growth factor (bFGF); bleomycin; pulmonary fibrosis; vascular injury; immunohistochemical method
肺间质纤维化是一种病因各异、表现相似的疾病谱，是各种弥漫型肺间质疾病的最终表现形式，其主要病理特点是肺内成纤维细胞过度增殖和细胞外基质的过多聚集。肺间质纤维化一旦形成，将不可逆地导致严重的甚至致命的呼吸循环功能障碍。有关肺纤维化发生的机理已有了较为深入的研究，但纤维化过程中肺组织、血管的损伤机制尚不清楚。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)具有强大的促进细胞分裂增殖的作用[1]，是各种原因所致肺间质纤维化形成机制研究的重点对象。在本研究中，我们应用免疫组织化学技术结合图像分析，观察博莱霉素(bleomycin, BLM)致大鼠肺组织纤维化中肺组织bFGF的表达，从血管损伤方面探讨bFGF在BLM致肺间质纤维化的发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 体重200-250g的健康雌性Wistar大鼠60只，由西安大学医学院实验动物中心提供。随机分为BLM组和生理盐水对照组，每组30只。
1.2 肺纤维化模型的建立 BLM组用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在无菌操作下作颈部正中切口，逐层暴露气管，用lmL注射器(前带7号针头)抽取含BLM(5mg/kg)的生理盐水0.2-0.3mL，经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管。将大鼠直立，继续朝向心端进针约1.0-1.5cm，回抽出空气并无阻力后，将药液注入气管，旋转动物，使药液在肺内分布充分、均匀。缝合伤口。对照组，在同样条件下，向气管内注入相同体积的生理盐水。两组动物分别于气管内灌注后3、7、14、21、28d随机处死动物各6只。
1.3 肺组织病理标本的制作 戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。常规消毒后开胸，暴露心肺，于右心室插入与输液器相连的针头，左心耳剪一约2mm左右切口，向右心室内灌注PBS(pH 7.4)冲洗血管至双肺呈白色胶冻状。结扎左主支气管，经气管向右肺注入40g/L多聚甲醛6mL，使胸膜展开，结扎气管后右肺置40g/L多聚甲醛中固定。上、中、下叶各取材一块，常规脱水，石蜡包埋，切片(5μm)。
1.4 bFGF免疫组织化学染色 采用免疫组化SABC法，bFGF多克隆抗体购自博士德公司。免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行：①石蜡切片常规脱蜡、脱水；②3%(体积分数)H2O2(蒸馏水新鲜配制)室温5min以灭活内源性酶，蒸馏水洗，3min×3；③复合消化液1min，蒸馏水洗，3min×3；④正常工作血清封闭液室温10min，甩去多余液体，不洗；⑤兔抗大鼠bFGF多克隆抗体(IgG型)，经预试验选择工作浓度为1∶100，4℃过夜，0.01mol/L PBS洗，3min×3；⑥生物素化山羊抗兔IgG抗体，37℃ 20min，0.01mol/L PBS洗，3min×3。⑦SABC试剂37℃ 20min，0.01mol/L PBS洗，5min×4；⑧DBA室温显色，蒸馏水洗；⑨苏木素复染，脱水、透明、封片。各组均设阴性对照切片，以0.01mol/L PBS代替一抗。
1.5 bFGF的定量分析 使用北京航空彩色病理图像分析系统。将待测切片放置在连接机的显微镜下观察。每组6只动物，每只动物取3张组织切片,每张切片取5个视野(上、中、下、左、右)，于高倍镜下(×400)检测bFGF平均吸光度值(A)。
1.6 统计学处理 采用SPSS12.0统计分析软件，各组间进行t检验和相关分析，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织的病理变化 ①大体标本：对照组双肺呈粉红色，表面光滑,开胸后迅速萎陷；BLM组可见双肺表面灶状分布的出血点，随时间延长上述改变由新鲜变为陈旧，肺表面可见点状、索条状淡黄色凹陷，开胸后肺组织萎陷不明显。②组织学观察：NS组各观察点均无明显改变。BLM组第3天可见肺泡壁水肿，炎性细胞渗出增多；第7天炎症更明显，为大片状炎性细胞浸润，成纤维细胞增多；第14天时肺泡炎仍较重，成纤维细胞进一步增多；第21-28天部分肺泡结构消失，局灶性纤维化和纤维结节形成，炎性细胞渗出有所减少。
2.2 bFGF在肺组织内的分布 各组大鼠肺组织bFGF多克隆抗体免疫组化染色阳性表达产物为棕黄色细颗粒状。两组动物的空白对照切片均未见阳性表达。NS组大鼠肺组织切片内见bFGF弱阳性表达,主要分布于支气管上皮细胞胞浆内,支气管和肺小动脉的肌层也有弱阳性表达(图1)。BLM组动物上述部位bFGF的阳性表达明显增强,支气管上皮细胞胞浆内、支气管和肺小动脉的肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内均可见较多棕黄色颗粒状强阳性表达产物(图2)。
图1 NS组肺组织中的bFGF的弱阳性表达（略）
Fig.1 The weak positive staining of bFGF in control groupSABC ×200
图2 BLM组肺组织中bFGF的阳性表达（略）
Fig.2 The positive staining of bFGF in Bleomycin group SABC ×200
2.3 bFGF表达的定量检测 定量分析结果显示，支气管上皮细胞、肺血管的肌层以及肺泡巨噬细胞胞浆内bFGF的表达于气管内灌注BLM后第7天即开始增高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，第28天时仍高于对照组 (P<0.05，表1)。
表1 对照组与BLM组bFGF表达水平的对比（略）
Table 1 The expression level of bFGF in control and Bleomycin groups
*P<0.05 vs. control group
3 讨论
肺纤维化是以肺内成纤维细胞过度增殖和细胞外基质的过多聚集,导致肺顺应性降低、容量减少，最终引起呼吸衰竭为特征的一组慢性病变。在肺纤维化过程中，随着肺组织损伤的发生，必然启动组织修复的一系复杂的调节过程，其中血管的修复和新生起着重要作用。研究表明，许多在血管新生中起重要作用的细胞因子在纤维化的发生过程中同样起着关键作用[2?3]。以往的研究资料表明在特发性肺间质纤维化、结节病、铍尘肺、氧中毒等多种疾病中均可见肺组织的bFGF表达上调，可能参与了其肺间质纤维化的发病过程[4]。成纤维细胞生长因子(FGF)是一种结构相关的多肽生长因子家族，具有很强的促细胞生长作用，能影响多种细胞的生长、分化及功能。根据其等电点的不同，FGF分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。资料表明，bFGF有很强的促血管壁细胞增生的作用，在体内和体外均能明显促进新生血管形成。将含有bFGF的海绵植入大鼠的皮下或腹腔,确认有强有力的血管新生作用[5]。bFGF在慢性阻塞性肺疾病气道重构和肺小动脉重建中也起着重要作用[6]。病研究表明，BLM诱导的肺纤维化早期变化以肺泡炎为主要特征[7?8]。肺泡炎又与血管损伤有密切关系，BLM作用后第3天电镜下即可观察到肺泡壁基底膜水肿、裸露、断裂，血管内皮细胞受损[9]。在本实验中，BLM作用后第3天即见炎症细胞渗出增多，至第7天炎症更加明显。伴随血管内皮的损伤，必然启动一系列的血管修复机制。实验表明，外源性bFGF对受损血管的内皮细胞、平滑肌细胞有促有丝分裂作用。bFGF对新生血管形成过程中多个环节均有促进作用，可趋化血管内膜的各类细胞，并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶、蛋白水解酶等。这些酶类通过促使血管内皮基膜降解和刺激内膜各类细胞的增值与迁移，诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔，并促进神经元与新生血管共同生长。本组实验结果显示,各组空白对照均无bFGF表达；对照组肺组织中bFGF呈低水平表达，主要表达于大气道壁和血管壁的平滑肌细胞；BLM组在博莱霉素给药后7d，bFGF表达提高，至给药后28d，仍有较高水平的表达。BLM给药后7d，组织炎症最为明显，导致血管内皮损伤启动血管修复机制，bFGF作为重要的血管活性物质,它的表达增高，作用于受损血管的内皮细胞、平滑肌细胞，促进血管新生。bFGF对成纤维细胞亦具有强烈的趋化和增生刺激作用，这说明bFGF在在肺纤维化过程中具有重要作用。本研究通过对bFGF表达水平的检测，从血管损伤方面进一步阐述了肺间质纤维化的发生机制，为探讨肺纤维化的提供了新方向。
基金项目：陕西省基金资助项目(No.2003C238)
【】
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