金纳多对抗大鼠脑出血后脑水肿的作用机制
作者：杨霄鹏，李秋芳，杨瑞玲
【摘要】 目的 探讨金纳多对抗脑出血后脑水肿形成的作用机制。方法 选健康Wistar大鼠80只，雌雄不拘，随机分为4组，每组20只。采用立体定向注射方法，用微量注射器在右侧尾状核部位，注入50μL生理盐水(A、B组)或等量自体血红蛋白(C、D组)。术后A、C组给予50g/L羧甲基纤维素钠溶液3mL灌胃，B、D组给予等量羧甲基纤维素钠溶解均匀的金纳多(200mg/kg)溶液灌胃，每日1次，持续3周。断头取脑，测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)值及血红素氧合酶?1(HO?1)阳性细胞数。结果 除A、B组比较无明显差异外，其余各组间SOD、MDA含量及HO?1阳性细胞数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 金纳多可以抑制血红蛋白所引起的脑水肿。
【关键词】 金纳多；脑出血；脑水肿；超氧化物歧化酶；丙二醛；血红素氧合酶?1
Rivalry mechanism of ginkgo in rat brain edema after intracerebral hemorrhage
ABSTRACT: Objective To investigate the rivalry mechanism of ginkgo in rat brain edema after intracerebral hemorrhage. Methods Totally 80 healthy Wistar rats were divided into 4 groups randomly (20 rats in each group). Fifty microliters saline (group A and group B) or auto?hemoglobin (group C and group D) was infused into the right caudate nuclears using stereo tactic guidance. Groups A and C were lavaged 50g/L carboxymethyl cellulose sodium solution of 3mL, groups B and D were lavaged the same amount of ginkgo (200mg/kg) solution dissolved by 50g/L carboxymethyl cellulose sodium solution once a day for 3 weeks. All the rats were decapitated after raised for 3 weeks, and superoxide dismutase, malondialdehyde, and the number of hemeoxygenase?1 (HO?1) positive cells in brains were assayed. Results The differences in SOD and MDA contents as well as HO?1 positive cell number between every two groups were significant (P<0.05) except group A and group B. Conclusion Ginkgo can inhibit brain edema after intracerebral hemorrhage caused by hemoglobin.
KEY WORDS: ginkgo; cerebral hemorrhage; brain edema; superoxide dismutase; malondialdehyde ; hemeoxygenase?1
红细胞自身溶解后释放的血红蛋白主要通过血红素氧合酶?1(hemeoxygenase?1, HO?1)进行降解，其降解产物可通过多种途径引起脑水肿。金纳多是一种标准化银杏叶萃取物，能改善缺血脑组织的能量代谢，保护细胞膜的结构和功能的完整性，对缺血神经细胞有保护作用[1?2]。本研究以脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)值及免疫组化HO?1为指标，观察金纳多对大鼠脑出血后脑水肿的保护作用，旨在为其广泛应用于临床防治脑出血后脑水肿提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 河南省实验动物中心提供的健康成年Wistar大鼠80只，雌雄不拘，体重260-300g。动物随机分为4组，每组20只。A组：注射生理盐水+溶剂；B组：注射生理盐水+金纳多+溶剂；C组：注射血红蛋白+溶剂；D组：注射血红蛋白+金纳多+溶剂。
1.2 仪器及主要试剂 SN?Ⅲ型立体定向仪(日本KCS公司)；Hamilton微量注射器(天津琛航科技仪器有限公司)；UV8500PC紫外分光光度仪(天美科技有限公司)；SABC免疫组化试验盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物有限公司；SOD、MDA试剂盒购自南京生物工程研究所。
1.3 大鼠尾状核出血模型及对照模型的建立 100g/L水合氯醛(2mL/kg)腹腔麻醉后头、股部备皮，络合碘消毒切开右股部皮肤，切口长10mm，剥离暴露股动脉。由股动脉抽取自体血2mL并加肝素抗凝(50u/mL)。3000r/min离心10min，弃去上层血浆及白细胞和血小板，用预冷生理盐水冲洗红细胞3次，移至EP管中离心后置-196℃液氮罐中5min，用37℃水浴至完全解冻，制成自体血红蛋白。将大鼠固定在立体定向仪上，头部正中切开皮肤，长约15mm，30g/L双氧水剥蚀骨膜暴露前后囟门，调节定向仪使前后囟在同一水平面上。于前囟前0.5mm、中线右侧旁开3mm处牙钻钻一直径约1mm的小孔，不伤及硬脑膜。微量注射器抽取50μL自体血红蛋白并固定于立体定向仪上，自钻孔处垂直进针5.5mm，以3-5μL/min速度向C、D组大鼠尾状核内推注并留置20min，以免血液自针道返流。A、B组则以50μL生理盐水注入。骨蜡封闭钻孔,缝合切口。将金纳多(200mg/kg)研磨成粉，用50g/L羧甲基纤维素钠溶解并混匀，术后48h予B、D组灌胃(10mL/kg)，A、C组用等量50g/L羧甲基纤维素钠溶液灌胃。各组均每日1次，持续3周。
1.4 标本收集与检测 生化指标检测：3周后脱臼法处死大鼠，断头取脑，滤纸擦干脑表面的液体，分析天平称重，按1∶9加入生理盐水匀浆，4000r/min离心10min，取上清液，制成10%脑组织匀浆。用硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量，再将10%脑组织匀浆稀释至1%，采用黄嘌呤氧化法检测SOD活力。按试剂盒操作程序进行测定。免疫组化检测：大鼠于出血3周后，100g/L水合氯醛腹腔麻醉，开胸暴露心脏，于心尖部剪一2mm左右小口，将穿刺针自此切口插入心脏并送达主动脉口处固定，37℃生理盐水200mL灌洗，继之以40g/L多聚甲醛溶液灌注内固定后断头取脑，置40g/L多聚甲醛溶液中后固定约8h，取尾状核部血肿周围脑组织，常规石蜡包埋，切片，进行免疫组化染色观察。HO?1免疫组化阳性细胞显色为胶质细胞胞浆棕黄色。计数方法：每张切片取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，每高倍视野下阳性细胞均数。
1.5 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行数据处理。实验数据用±s表示，对结果进行方差齐性检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较用LSD法。取α=0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 生化指标 脑组织SOD活性变化：A、B组明显高于C、D组(P<0.01)；A、B组间无明显差异(P>0.05)；D组较C组明显升高(P<0.01)。脑组织MDA含量变化：A、B组明显低于C、D组(P<0.01)； A、B组间无明显差异(P>0.05)；D组较C组明显降低(P<0.01，表1)。
表1 各实验组脑组织SOD活性、MDA含量的变化（略）
Table 1 SOD and MDA contents in the 4 groups
Group A: NS+solvent; Group B: NS+ ginkgo +solvent; Group C: hemoglobin +solvent; Group D: hemoglobin + ginkgo +solvent; *P <0.01 vs. groups C, D; △P<0.01 vs. group D
2.2 HO?1染色阳性细胞数的变化 每高倍镜下HO?1阳性细胞数：A组(30.90±3.67)、B组(30.50±4.19)显著低于C组(51.30±7.94)﹑D组(38.10±4.89)(P<0.01)；A、B两组差异无统计学意义(P>0.05)；C组显著高于D组(P<0.01)。表达特点：各组均见HO?1阳性表达，可见星形胶质细胞胞浆呈棕黄色且较深，胞体肥大，突起增粗，数量增多(图1)。
图1 各组HO?1的阳性表达情况（略）
Fig.1 The expression of HO?1 in Groups A, B, C and D ×400
A: group A; B: group B; C: group C; D: group D
3 讨论
血红蛋白的过氧化作用是脑水肿产生的重要原因[3]。脑出血时，破碎红细胞释放大量血红蛋白，血红蛋白在HO作用下生成CO、Fe和胆绿素。这些代谢产物是过氧化剂和自由基的重要来源，通过细胞的氧化和过氧化应激，打破氧化和过氧化之间的平衡，对细胞产生特定的氧化毒性，造成脑水肿的发生。作为受自由基损害而产生的过氧化产物——MDA，其含量的多少能有效反映细胞损伤和机体受自由基攻击程度。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是O-2最有效的清除剂，它通过催化歧化反应来清除O-2，抑制脂质过氧化。本实验测得A、B组SOD无显著性差异(P>0.05)，说明金纳多并不能明显增强正常鼠的SOD活性；C组明显低于其他组，D组显著高于C组(P<0.01)而低于A、B组(P<0.01)，提示脑出血后大鼠SOD活力下降，金纳多能明显增强脑出血后大鼠SOD活力。A、B组MDA无显著性差异(P>0.05)，说明金纳多对正常鼠自由基损害影响不大，C组明显高于其他3组(P<0.01)，表明出血后自由基生成增多，清除能力下降，组织脂质过氧化损害；D组低于C组(P<0.01)而高于A、B组(P<0.01)，说明金纳多在大鼠脑出血后具有抗自由基、抗脂质过氧化作用。HO?1是催化血红素转变为CO、Fe和胆绿素的限速酶，对氧化应激十分敏感。有学者观察到，HO?1最明显的诱导部位恰恰就发生在出血部位及其相邻部位[4]，因此脑内胶质细胞中HO?1的诱导表达可作为脑损伤的一个标志。HO?1表达显著的区域脑损伤程度越严重。脑出血后HO?1上调表达的机制，可能与以下因素有关：出血后红细胞释放的血红蛋白直接诱导了HO?1基因[5]；血脑屏障损害后，多种血浆成份漏入脑实质，可诱导HO?1的表达[6?7]；HO?1基因上有血红素结合位点，血红蛋白的降解产物血红素作为底物，直接诱导HO?1基因表达[8]；血红素诱导的过氧化反应使体内自由基增高，氧自由基通过激活HO?1基因启动区的细胞因子(NF?κB)和活性蛋白(AP?1)调节HO?1 mRNA转录和蛋白合成的增加[9]。在本实验中，A、B组几乎未见HO?1阳性表达，D组HO?1阳性细胞有轻微表达，可见一些散在的胞浆呈棕黄色着色且颜色较深，胞体肥大的细胞，但数目明显比C组少；D组与C组之间差异具有显著性(P<0.05)。说明D组的大鼠脑过氧化损伤程度比C组小，可以认为金纳多针对血红蛋白所诱导的脑水肿有减轻和抑制作用。金纳多为第四代银杏叶提取制剂，含有24%的银杏黄酮甙和6%的萜类。黄酮类化合物的结构中含有还原性羟基功能团，是一类较强的抗氧化剂，不但可直接发挥抗氧化作用，清除O-2，还可调节SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性[10]。萜类没有直接清除氢氧基团的作用，但能提高黄酮清除氢氧基团的能力，这与萜类的支架样结构有关。另外，金纳多通过其具有的扩张脑血管、改善微循环、减少毛细血管通透性等作用促进血肿吸收，或通过某些尚不明确的机制直接抑制HO?1的上调表达，从而减少血红蛋白降解，切断了过氧化剂和自由基的重要的来源，保护了神经细胞，减轻了脑水肿。
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