慢性神经病理性痛对小鼠细胞免疫功能的影响
作者：邵玲巧，袁育康，王军阳，任会勋
【摘要】 目的 探讨慢性神经病理性痛对小鼠细胞免疫功能的影响。方法 在通过结扎小鼠单侧胫神经和腓总神经建立慢性坐骨神经病理性疼痛模型的基础上，利用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和酶联免疫吸附试验(ELISA)动态观察慢性神经病理性疼痛对Ｔ淋巴细胞增殖活性以及血清中肿瘤坏死因子?α(TNF?α)和白介素?6(IL?6)水平的影响。结果 神经病理性疼痛模型小鼠的T淋巴细胞增殖活性明显高于假手术组及对照组，外周血液中的TNF?α和IL?6亦明显高于假手术组及对照组。结论 小鼠在慢性神经病理性疼痛状态下细胞免疫功能明显增强。
【关键词】 神经病理性痛；肿瘤坏死因子；白介素?6；Ｔ淋巴细胞
The influence of chronic neuropathic pain on cellular immune function of mice
ABSTRACT: Objective To explore the influence of chronic neuropathic pain on cellular immune function of mice models. Methods The mice models were established by ligating tibeal nerve and common peroneal nerve on one side, and the influence of chronic neuropathic pain on cellular immune function and tumor necrosis factor?α(TNF?α) and interleukin?6 (IL?6 ) was observed with lymphocyte cell increase experiment (MTT method) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results The increased reactivity of T lymphocyte of the model group was significantly higher than that of the sham group and the control group. At the same time, content of TNF?α and IL?6 in blood of the model group also increased. Conclusion Cellular immune function of mice is increased in the state of chronic neuropathic pain.
KEY WORDS: chronic neuropathic pain; tumor necrosis factor?α; interleukin?6; T lymphocyte
神经病理性痛多见于肿瘤、椎间盘突出、三叉神经痛等，其发病机理目前尚不清楚。本研究通过建立小鼠慢性神经病理性痛模型，探讨神经病理性疼痛对T淋巴细胞增殖活性以及血清中肿瘤坏死因子?α(tumor necrosis factor?α, TNF?α)和白介素?6(interleukin?6, IL?6)表达的影响，从而为研究其发生的免疫机制以及筛选具有镇痛作用的免疫制剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 动物模型建立 雄性ICR小鼠(16-18g)购自西安大学医学院实验动物中心。通过腹腔注射乌来糖(1.4g/kg)麻醉动物，3-4min后沿小鼠右下肢股部横向切开皮肤，钝性分离肌肉并暴露坐骨神经，玻璃针钝性分离坐骨神经的三个主要分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经，用0号手术丝线分别紧扎胫神经和腓总神经，同时确保腓肠神经不受损伤。随后止血、逐层将肌肉和皮肤缝合。术后1周进行模型筛选。假手术组除不结扎神经外，其余与神经病理性痛模型相同[1?2]。
1.2 动物模型筛选 参照Jasmin等[3]的冷盘法即冷刺激诱发的痛觉超敏进行动物模型筛选。将模型小鼠放在表面温度为(4±1)℃的冷盘上，上罩一个500mL的烧杯，小鼠在冷盘上适应5min，待小鼠的探究活动基本消失后，记录小鼠患侧爪在5min内的累积抬爪次数(小鼠活动或体位变化所引起的抬爪不记入内)，患侧爪5min内累积抬爪次数大于10次的作为痛模型小鼠。同时测定假手术组和对照组小鼠的右侧爪在5min内累积抬爪次数[4?5]。
1.3 小鼠外周血中TNF?α、IL?6含量的测定 将模型组(100只)、假手术组(100只)和对照组(100只)小鼠随机分为10组，每组约10只。分别在动物模型建立后第1、2、3、5、8、11、14、17、20、23周采集外周血，分离血清并放于含蛋白酶抑制剂的冷磷酸缓冲液中(-20℃保存)，待测TNF?α、IL?6含量(采血后的小鼠迅速处死，无菌状态下取其脾脏备用)。ELISA法检测TNF?α、IL?6(检测试剂盒由晶美生物公司提供)。
1.4 T淋巴细胞增殖活性的测定(MTT法) 将不同时间无菌状态下取得的脾脏剪碎，分别放在200目金属滤网轻轻研磨后，制成2×106/mL的细胞悬液。将制成的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个样品6孔(3个刺激孔，3个对照孔)，每孔加细胞悬液100μL，3μg/mL PHA 100μL(3个对照孔不加)。将细胞培养板放于37℃、50mL/L CO2细胞培养箱内培养66h后，每孔加入5mg/mL MTT 20μL，继续培养6h，离心弃上清液后每孔加二甲基亚砜溶液100μL，用酶标测定仪测每孔在570nm波长处的吸光度(A)值。刺激指数(SI)=刺激孔A值/对照孔A值[7]。
1.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差(±s)表示。统计学分析采用SPSS11.0统计学软件进行one?way ANOVA分析，P<0.05为具有统计学差异。
2 结果
2.1 模型小鼠冷刺激诱发的痛觉超敏 在动物模型建立后不同时间检测模型组的患侧爪和假手术组、对照组的对照侧爪痛觉的改变(表1)。实验各周模型组的患侧爪5min内累积抬爪次数比假手术组、对照组的对照侧爪均明显增加(P<0.05)。而假手术组和正常对照组的对照侧爪的抬爪次数无统计学差异(P>0.05)。
表1 不同时间实验组小鼠5min内累积抬爪次数的比较（略）
Table 1 Comparison of numbers of paw lift in 5 minutes in defferent weeks
*P<0.05 vs. sham group
2.2 神经病理性痛模型小鼠外周血中TNF?α、IL?6含量的变化 模型组小鼠外周血中TNF?α、IL?6质量浓度均比假手术组明显增高(P<0.01)；假手术组小鼠外周血中TNF?α、IL?6与对照组比较无明显变化(P>0.05，表2)。
表2 不同时间各组实验小鼠外周血中TNF?α、IL?6含量的比较（略）
Table 2 Comparison of the content TNF?α and IL?6 in blood in defferent weeks
**P<0.01 vs. sham group
2.3 各组实验小鼠T细胞增殖活性的改变 动物模型筛选后不同时间检测实验各组T增殖细胞活性SI值。模型组的T细胞增殖活性比假手术组明显升高(P<0.05)；假手术组T细胞增殖活性与对照组比较无明显变化(P>0.05，表3)。
表3 不同时间各组实验小鼠T细胞增殖活性的比较（略）
Table 3 Comparison of increased reactivity in T lymphocyte in defferent weeks
*P<0.05 vs. sham group
3 讨论
为了研究神经病理性痛的发病机制，许多研究者建立了各种各样的动物疼痛模型。这些模型从不同的角度模拟神经损伤引起的神经功能紊乱和神经病理性痛，为认识和探究神经病理性疼痛的机制以及筛选性药物提供了良好的工具。模型一般都是人为损伤动物的感觉传导通路造成的，损伤的部位为外周神经干、脊神经、背根及脊髓等；损伤的方法以机械损伤(如横切或结扎)为主，也有采用冰冻或缺血性损伤等方法[6?7]。但目前用于神经病理性痛模型的动物多采用大鼠，至于小鼠，目前采用的较少。其实小鼠遗传背景已比较清楚，并且小鼠价格低廉，饲养方便，故用小鼠作为神经病理性痛的模型动物会更具潜力。本实验利用小鼠成功建立了神经病理性痛模型。模型鉴定结果显示在实验第1-23周模型组小鼠出现了明显的冷刺激诱发的痛觉超敏，5min抬爪次数与假手术组、对照组小鼠比较有显著性差异(P<0.05)。分析造成小鼠痛觉明显改变的原因：一方面可能是胫神经和腓总神经结扎后造成神经疼痛；另一方面可能是手术时造成的肌肉等组织损伤引起的。从假手术组与对照组实验结果来看，手术造成的肌肉组织等损伤并未引起实验小鼠的痛觉明显异常(P>0.05)。因而，模型组小鼠痛觉明显异常主要是由于胫神经和腓总神经结扎所致。提示慢性神经疼痛小鼠模型制作成功，而且该模型可维持5个月以上，是一种较为理想的神经病理性痛模型。神经病理性疼痛是临床上常见的一种难治病，但其发病机理，尤其是免疫机制目前尚不清楚。本研究在成功建立慢性神经病理性疼痛模型小鼠的基础上，进一步研究了神经病理性疼痛对小鼠细胞免疫功能的影响。结果显示，在神经损伤发生后第1-23周小鼠T淋巴细胞增殖活性明显增强，模型组小鼠外周血中TNF?α、IL?6水平与假手术组、对照组比较也明显增高(P<0.01)。提示神经病理性痛可引起T淋巴细胞功能的增强，同时可增加TNF?α、IL?6等可溶性细胞因子的释放。这些细胞因子兴奋末梢神经，而这些神经终止于大脑或脊髓背角神经元，继而可兴奋神经闭合环路传出信号系统引起痛觉异常。综上所述，慢性神经病理性痛可导致小鼠Ｔ淋巴细胞增殖活性增强，促进TNF?α、IL?6可溶性细胞因子的释放，从而可能在疼痛的发生和维持过程中发挥重要的作用。
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