葎草花粉致敏蛋白多克隆抗体的制备及其在筛选致敏蛋白组分的应用
作者：李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉
【摘要】 目的 制备、鉴定兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体，并初步应用于葎草花粉致敏蛋白组分的筛选。方法 用葎草花粉变应原浸液免疫兔，获得高效价抗葎草花粉蛋白抗血清，应用琼脂免疫双扩散、ELISA法以及Western blotting鉴定产生的抗体。同时对葎草花粉过敏性哮喘患者血清进行Western blotting检测。结果 兔抗血清效价经ELISA检测，效价>1∶10000，免疫双扩散结果表明抗血清只与葎草花粉变应原形成特异性IgG沉淀线，Western blotting检测兔抗血清IgG可以特异性识别葎草花粉8种蛋白组分，分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38ku，患者血清IgG可以识别5种蛋白组分，分子质量分别为100、76、55、49、38ku。结论 制备的兔抗血清具有较高效价和较好的特异性，应用该血清筛选出的葎草花粉致敏蛋白组分与患者血清筛选的组分相似，因此可进一步应用于初筛cDNA表达文库。
【关键词】 李雅莉，孙秀珍，高燕华，刘昀，张洁，冯向莉
在我国，葎草是仅次于蒿属的重要的夏秋季致敏花粉，受累人口众多。葎草花粉飘散的高峰时间较长，诱发的症状较重，患者常常要求进行特异性免疫(specific immunotherapy, SIT)，并希望能长期治疗。目前临床上使用的葎草花粉变应原浸液质量难以标准化，在诊断和治疗方面存在很多不足之处，而基因工程生产的重组变应原则能够克服天然变应原浸液的局限性。国内外研究证实采用构建cDNA文库、分离单一过敏原蛋白及氨基酸序列分析相结合的方法，是研究过敏原基因的首选方法。选择高效价的抗体作为筛选cDNA文库探针，是进行诊断和治疗用重组变应原疫苗的前提。目前国内对于寄生虫cDNA文库的筛选多选用免疫动物血清[1?3]，而对于引起变态反应性疾病的过敏原基因阳性克隆筛选多用患者血清[4]，未见有应用动物多克隆抗体和人抗血清同时筛选文库的报道。在已构建葎草花粉cDNA文库基础上，如何快速地筛选特异的致敏蛋白组分成为研究致敏原基因的关键。本文旨在比较兔抗葎草花粉多克隆抗体与人抗葎草花粉血清特异性识别抗原结果，筛选出葎草花粉致敏蛋白组分的快速而特异的方法，为重组葎草花粉变应原的生产和临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，山羊抗人IgG(北京鼎国进口分装)，标准蛋白(Sigma公司)，PVDF膜(北京鼎国进口分装)。
5415D型高速离心机(德国eppendorf公司)，85?2型恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)，Vcx 500型超声细胞粉碎仪(Sonics &MATERIALS)，全自动凝胶成像分析系统(美国Bio?Rad公司 Gel Doc 2000)，POLARstar酶标仪(德国BMG 公司)，ＣＡＰ变应原体外检测系统(瑞典Pharmacia公司)，微型垂直电泳仪、转印仪(美国Bio?Rad公司)，UV?3000紫外/可见分光光度计(日本岛津公司)。实验动物：健康雄性白兔2只，体重1.9?2.0kg，购自西安大学医学院实验动物中心。
1.2 血清收集
阳性患者血清：临床上选择对葎草花粉变应原点刺试验(SPT)≥?的过敏性哮喘患者10例，其中男5例，女5例，取静脉血3mL。分离血清后，用法玛西亚CAP变应原自动检测系统，收集对葎草花粉变应原特异性反应阳性达2级或2级以上患者血清，分装后-70℃保存。阴性对照血清：4例无变态反应史健康人，各种变应原点刺试验阴性，取静脉血3mL，分离血清后，-70℃保存。
1.3 葎草花粉变应原浸液的制备
脱落法收集葎草花粉，9号分样筛过筛，室温下乙醚脱脂。取脱脂花粉5g加Coca?s液100mL，超声粉碎(约150W，超声时间5s，间隔5s，工作次数30次)后4℃下搅拌提取72h，4℃下13000×g离心30min，取上清。上清液以去离子水透析24h，自然蒸发浓缩。除菌滤过后经灭菌检查显示花粉粗制提取液灭菌完全，无细菌生长，可以免疫使用。并经考马斯亮蓝结合法测定致敏蛋白，样品终质量浓度为5.4g/L。
1.4 兔抗血清制备
选2只3月龄、体重1.9-2.0kg的健康雄性家兔。免疫前3d，于兔耳缘静脉采血留作阴性对照。将一定量的葎草花粉粗制浸液同等量的弗氏完全佐剂充分乳化后进行第1次基础免疫，于兔背部皮下多点注射，每兔注射2mL；2周后进行强化免疫, 将一定量的葎草花粉粗制浸液同等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，剂量同前。以后每隔1周进行一次加强免疫，剂量、部位同前。从第3次加强免疫开始，每次免疫后1周于兔耳缘静脉采血测抗体效价。当效价符合要求时颈动脉采血，37℃静置1h，收集析出血清，4℃下10000×g离心10min，收集上清，-20℃冰箱冻存，备用。参照Hebert等方法对该抗血清进行纯化，得到抗葎草花粉蛋白的多克隆抗体。
1.5 抗葎草花粉蛋白抗血清的鉴定
1.5.1 双向免疫扩散法测定抗体的特异性
用生理盐水配制20g/L琼脂凝胶，置水浴中煮沸融化后，用吸管吸取融化的琼脂3mL趁热均匀浇注于载玻片上，厚度约为1.5mm。待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，1个中心孔，6个周边孔，孔径3-4mm，孔间距3-5mm。用微量加样器吸取样品分别加入小孔内，每孔8μL，中心孔加入兔抗血清，周围孔分别加入葎草、艾蒿、藜草、黄蒿花粉提取液。加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24-48h后观察结果。
1.5.2 用间接ELISA法测定抗体效价
以葎草花粉变应原浸液的100倍液包被酶标板，每孔100μL，于湿盒内4℃过夜。弃去包被液，以pH7.4的PBS Tween 20(体积分数为0.1%)洗涤液洗涤酶标板各孔3次×3min，再以含5%脱脂奶粉的PBS?Tween 20(体积分数为0.1%)200μL/孔封闭酶标板，于湿盒内37℃温育1h。取出后洗涤3次，甩干，加入不同稀释度的兔抗血清和免疫前兔血清100μL /孔，空白对照孔不加抗血清，37℃孵育1.5h。洗涤3次后甩干，加入1∶2000 HRP?羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育1h。洗涤同前，加入底物邻苯二胺溶液，37℃恒温0.5h，取出后加入2mol/L H2SO4溶液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取波长为490nm时的吸光度值(A)。
1.6 Western blotting检测抗血清与葎草花粉变应原IgG反应性
采用不连续SDS?PAGE体系[6]，制备50g/L的浓缩胶、120g/L的分离胶，对粗提液中蛋白质组分进行电泳分离，取下凝胶，进行电转印，恒压(25V)，转印时间为2.5h。在实验中兔抗血清1∶100稀释，患者血清1∶10稀释，羊抗兔IgG?HRP、羊抗人IgG?HRP工作浓度为1∶2000和1∶200；用DAB显色。
2 结 果
2.1 抗体的特异性
中心孔为兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体时，只有葎草花粉粗制提取液与中心孔IgG沉淀线形成。
2.2 抗体效价
表1显示不同倍比稀释的混合兔抗血清与空白兔血清的A值，兔抗血清可稀释较大倍数，抗体稀释度>1∶10000 A值的比值大于2，抗原与抗体最适合结合的抗体浓度为1∶100-1∶1000。我们以1∶100作为以后实验的抗体工作浓度。表1 间接ELISA法测定抗葎草花粉蛋白多克隆抗体效价（略）
2.3 Western blotting检测结果
图1显示：以兔抗血清为一抗时，可见8条IgG反应带，分子质量分别为100、88、76、69、65、55、49、38ku。以患者血清为一抗时，可见5条IgG反应带，分子质量分别为100、76、55、49、38ku。
3 讨 论
构建葎草花粉cDNA文库，制备高效价的抗体用于免疫学方法筛选文库，是目前发现并获取特异性基因克隆，并应用于重组葎草花粉变应原疫苗和诊断抗原研究的首要前提。目前国内对于过敏原基因阳性克隆筛选多选用患者血清，但特异性高的患者血清不易获得，动物多克隆抗体制备时间短，投资小，滴度较高，特异性较好，可用来进行免疫初筛。研究结果表明，用葎草花粉变应原对白兔进行多次免疫，可制备兔抗葎草花粉蛋白多克隆抗体。免疫双扩散以及ELISA证实通过该方法获得的多克隆抗体特异性较强、效价较高。通过应用Western印迹，可以比较兔抗葎草花粉多克隆抗体与人抗葎草花粉血清识别特异性抗原的差异。本研究显示，两者所识别的抗原成分具有相似性，其中100、76、55、49、38ku均可被兔抗血清和患者血清识别。与患者血清相比，兔抗血清识别的条带更多，提示其敏感性高于患者血清。其原因可能为兔血清是用特定抗原免疫获得的，抗体效价较高，而人抗体是经接触抗原产生的，抗体效价低，放置时间过久，从而效价降低，使其难以检测。总之，本研究证实，用葎草花粉变应原浸液免疫兔获得的多克隆抗体具备了识别抗原的高度特异性，满足免疫初筛文库的要求，并具有生产成本低、简单快速、敏感易行、效果好的优点和较强的实用性。
【】
/[1/]凌家俭，章子豪，张耀娟. 卫氏肺吸虫成虫cDNA文库的多抗筛选 /[J/]. 南京医科大学学报, 2001,21(6):473?476.
/[2/]王敏，易新元，曾宪芳. 肝门型童虫免疫血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 /[J/]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2003, 23(5):364?365.
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/[4/]周珍文，刘志刚，陈玲等. 蟑螂变应原基因的免疫学筛选及序列分析 /[J/]. 中华检验医学杂志, 2003, 26(10):594?597.
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