细胞外ATP对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响
作者：钱军，马延超，夏亚一，汉华，孙正义
【摘要】 目的 研究细胞外ATP对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响。方法 健康成年Wistar大鼠20只，雌雄不限，体重280-320g，平均300g，制作成脊髓打击伤动物模型，并随机分为两组：A组(ATP组)和B组(对照组)，每组10只。伤后1、3、7、14、28d用改良的Tarlov 评分、斜板试验观察大鼠运动功能的恢复情况。 结果 大鼠脊髓损伤后A组改良的Tarlov 评分、斜板试验优于对照组，在14d和28d，改良的Tarlov 评分、斜板试验A组明显优于B组(P<0.05)。结论 细胞外ATP能促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。
【关键词】 脊髓损伤；ATP；运动功能；大鼠
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)时机体历经原发性损伤和继发性损伤的序贯过程，造成不同程度的神经元和胶质细胞的坏死、凋亡，轴突的断裂、脱髓鞘，临床表现为损伤平面以下不同程度的感觉、运动和大小便功能障碍。脊髓损伤后功能恢复的核心机制被认为是启动了潜伏的突触和神经环路以及残存的神经元轴突侧支发芽，并和靶细胞形成新突触，从而实现神经环路的结构重组[1]。因此，脊髓损伤后，提高神经元的存活质量，促进神经元轴突的生长是恢复脊髓功能的关键。ATP作为一种价格低廉、安全性高的传统能量物质，对神经系统的作用已经引起了国内外学者们的重视。最近的研究表明，细胞外ATP具有保护脊髓神经元的作用，并能促进外周神经再生轴突生长、成熟[2]。对于细胞外ATP对脊髓损伤后运动功能恢复的影响，未见报道，本文通过行为学检查，观察细胞外ATP对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组
健康成年Wistar大鼠(兰州大学实验动物中心提供)20只，雌雄不限，体重280-320g，平均300g，制作成脊髓打击伤动物模型，并随机分为两组：A组(ATP组)和B组(对照组)，每组10只。
1.2 脊髓损伤动物模型的制作方法
用100g/L(10%)水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定，取后正中切口，显露椎板及棘突，明确T10棘突后咬除T9-11棘突、T10全部椎板和T9、T11上、下各半个椎板，Allen 法用自制打击器制作脊髓打击伤动物模型，打击强度为30gcf，造模成功后，逐层缝合切口。造模成功的标志：在Allen 装置撞击脊髓的瞬间，动物身体抖动，双下肢迅速发生回缩及弹动动作，尾巴痉挛性摇动，表明撞击成功。术后大鼠自由进食、饮水，控制室温在18-22℃，定时清洁笼具，每天挤压膀胱排尿2-3 次，直至膀胱功能恢复。
1.3 给药方法
A组动物在打击完成后，经暴露的硬脊膜注射ATP(5mg/kg)至硬脊膜下损伤周围组织，缝合伤口后即经腹腔注射ATP(40mg/kg)，以后每天经腹腔注射同等剂量的ATP 1次；B组动物注射方法同A组，给予等量的生理盐水作为对照。
1.4 行为学检查
A、B两组动物分别于伤后1、3、7、14、28d行改良的Tarlov 评分、斜板试验，对大鼠进行行为及肢体运动功能检测，观察伤后各时相点大鼠后肢活动、肌力等，以此评定ATP处理前后大鼠运动功能的恢复情况。①改良的Tarlov 评分：0分，没有自主性运动；1 分，仅限于髋、膝关节的非反射性运动；2分，肢体髋、膝、踝3个主要关节的运动；3分，能主动支持体重和不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分，前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分，正常步态[3]。②斜板实验：采用Rivlin法[4]，将大鼠放置于一长方形木制斜板上，上面垫一橡胶垫，斜板可旋转测量斜板角度。将大鼠身体纵轴与斜板纵轴平行放置，大鼠头朝斜板抬高侧，以再抬高5°时大鼠能停留5s的最大角度为测定值，每只动物测5次，取其平均值作为测定值。
1.5 统计学分析
所有数据均以±s表示，应用SPSS12.0软件进行统计分析，组内比较采用单因素方差分析，LSD 法进行两两比较；组间比较采用两样本的t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
两组大鼠脊髓损伤后1d改良的Tarlov 评分、斜板试验最低，3d后开始升高，7-14d升高较快，A组大鼠损伤后14d改良的Tarlov评分、斜板试验明显高于损伤后7d(P均小于0.01)，B组大鼠损伤后14d改良的Tarlov评分也明显高于损伤后7d(P<0.05)，两组大鼠改良的Tarlov 评分、斜板试验均在损伤后28d达到高峰。损伤后1、3、7d两组大鼠改良的Tarlov评分、斜板试验无明显差别，A 组和B 组大鼠都表现为双后肢不同程度的瘫痪。在损伤后14d和28d，改良的Tarlov 评分A组明显高于B组 (P均小于0.05)；斜板试验A组也明显高于B组(P均小于0.05)，两组大鼠的运动功能都得到了不同程度的恢复，且 A 组大鼠的运动功能恢复明显好于B组。见表1、表2。表1 脊髓损伤大鼠改良的Tarlov评分结果（略）表2 脊髓损伤大鼠斜板实验结果（略）
3 讨 论
脊髓损伤后，提高神经元的存活质量、促进神经元轴突的再生是恢复脊髓功能的关键，而受损神经元的存活及轴突的再生受内外环境多种因素的影响。近年来，细胞外ATP对神经系统的作用逐渐引起学者们的重视。ATP是体内重要的生物活性物质，参与体内的多种生理、病理过程，细胞内ATP是经典的供能物质，而细胞外ATP 则是功能复杂的信号分子。在神经系统中，ATP可作为神经递质、神经调质和神经营养因子作用于神经元、各种胶质细胞和内皮细胞参与神经系统的发育、分化、增殖、凋亡、损伤和再生过程[5]。研究表明，细胞外ATP 是通过其受体发挥生物学效应的。ATP受体属于嘌呤能受体，根据受体对配体的敏感性不同，P受体可分为P1和P2，其中P1受体主要介导腺苷和AMP 的作用，属于G?蛋白偶联受体；P2受体则主要介导ATP和ADP的作用，按其药和分子结构的不同，P2受体可以被分为P2x受体和P2y受体两种类型。P2x受体属于配体门控性非选择性阳离子通道受体，主要分布在脊髓背根神经节的小细胞及感觉神经末梢，其功能主要与感觉传导、尤其是与疼痛的产生、传导有关；P2y受体属于G?蛋白偶联受体，主要分布在中枢神经系统、平滑肌细胞、上皮细胞、血管内皮细胞及某些腺上皮细胞，与这些细胞的增殖、分化及功能活动密切相关。本实验观察到两组大鼠的运动功能在损伤后28d均得到了不同程度的恢复，ATP组大鼠的运动功能在损伤后14、28d明显好于对照组，表明成年大鼠脊髓损伤后仍存在一定的再生能力，细胞外ATP能促进大鼠脊髓损伤后的这种再生，从而促进大鼠运动功能的恢复。大鼠脊髓损伤后即使未经，缺损的神经功能也可逐渐恢复，提示脊髓损伤后神经功能缺损存在着一定程度的自我恢复，即脊髓的神经功能也存在着一定的可塑性，推测大鼠脊髓损伤后的这种神经功能可塑性除了与脊髓损伤后水肿消退有关以外，残存脊髓组织的结构可塑性也起了重要作用，其机制可能是损伤区或其周围区域残留的神经元轴突残端出芽或侧支出芽，并延伸至相应的靶细胞，形成突触联系，重建相应的神经环路，从而恢复或部分恢复了对靶细胞的神经支配。有研究表明，损伤的脊髓若能保留10%的轴突，就可重建部分神经环路，使损伤脊髓的功能有所恢复；脊髓锥体束中的神经纤维保留10%以上，该侧肢体肌肉就可有2/5以上的功能[6]。ATP在脊髓损伤修复过程中能促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，其作用机制可能是多方面的，既有直接作用，又有间接作用，但最终是通过其受体发挥作用的。推测ATP 的作用类似于一种神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)，作用于神经细胞膜上的相应受体，引起细胞内的一系列级联反应，最终导致细胞核内相关基因的表达。研究表明，核苷酸类物质不仅可直接作用于神经元，也可刺激胶质细胞合成和分泌NGF、NT?3等神经营养因子并与其起协同作用[7]。另外，在中枢神经系统，细胞外ATP 通过受体还可以发挥促进血液循环的作用，并能促进胶质细胞特别是星形胶质细胞的再生，进而对神经细胞发挥保护作用[8]。细胞外ATP还具有生长因子的作用，能促进某些DNA、蛋白质的合成，促进细胞增殖等，具有生长因子的一些特性[9]。总之，细胞外ATP 能促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，其作用机制可能是多途径的，细胞外ATP除了对于神经元的直接作用以外，对于神经再生局部的胶质细胞也能发挥作用，从而改变了轴突再生的局部微环境，而血供的增加， 也会对轴突再生发挥作用。此外，ATP 在体内的代谢产物腺苷二磷酸、腺苷一磷酸和腺苷都有传递信息的作用，后者可作用于P1嘌呤能受体，并通过cAMP、IP3等信息传导通路影响神经元和胶质细胞，但ATP究竟是如何从分子水平促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复的，尚需进一步研究。
【】
/[1/]张绍文,王栓科,王翠芳，等. 慢性压迫性脊髓损伤后神经前体细胞的增殖情况 /[J/]. 中华创伤杂志, 2004, 20:402?405.
/[2/]王栓科,洪光祥,王同光，等. 细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究 /[J/]. 中华手外科杂志, 2002,18:43?45.
/[3/]王民，王栋琪，宋焕瑾. 脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复不同评分标准的比较 /[J/]. 西安大学学报(医学版), 2006, 27(3):243?245.
/[4/]Rivlin AS, Tator CH. Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in rat /[J/]. J Neurosurg, 1977, 47:577?581.
/[5/]Irnich D, Tracey DJ, Polten J, et al. ATP stimulates peripheral axons in human, rat and mouse?differential involvement of A(2B) adenosine and P2X purinergic receptors /[J/]. Neuroscience, 2002, 110:123?129.
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/[7/]Ramer MS, Bradbury EJ, McMahon SB. Nerve growth factor induces P2X(3) expression in sensory neurons /[J/]. J Neurochem, 2001, 77: 864?875.
/[8/]Neary JT, Kang Y, Bu Y, et al. Mitogenic signaling by ATP/P2Y purinergic receptors in astrocytes: involvement of a calcium?independent protein kinase C, extracellular signal?regulated protein kinase pathway distinct from the phosphatidylinositol?specific phospholipase C/calcium pathway /[J/]. J Neurosci, 1999, 19: 4211?4220.
/[9/]Erlinge D. Extracellular ATP: a growth factor for vascular smooth muscle cells /[J/]. Gen Pharmacol, 1998, 31:1?8.
