人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建
【摘要】 目的 通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体，为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法 从人甲状腺组织中提取总RNA，RT?PCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果 经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论 成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。
【关键词】 人TSHR膜外区；RT?PCR；真核表达载体
在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor, TSHR)是重要的自身抗原[1]，机体产生针对TSHR的自身抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本文从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建真核表达载体，建立了有效的TSHR体外表达系统。
1 材料与方法
1.1 组织来源和实验材料
甲状腺组织来源于已确诊的Graves手术患者。DH5α感受态细菌购于北京鼎国生物技术有限公司，pMD18?T克隆载体系日本TaKaRa公司产品，真核表达载体pcDNA3.1(+)系美国Invitrogen公司产品。RNAgents? Total RNA Isolation System和Accesss RT?PCR System为Promega公司产品，质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。
1.2 PCR引物的设计合成
根据报告人促甲状腺激素受体cDNA 序列资料[2]，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增 hTSHR 膜外区cDNA 编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′?ATTGGATCCAACATGGATATGAGGCCGGCGGACTT?
GCT?3′，下游引物为5′?GCCGAATCCCTACTTGTAGCCCATTATGTCTTCACAC?3′。
1.3 总RNA的提取
冻存的约100mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿?异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。
1.4 RT?PCR及产物的纯化
RNA样品预处理于75℃变性5min后速放冰上冷却。RT?PCR反应体系：AMV反转录酶(5u/μL)1μL，Tfi DNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/Tfi Buffer 10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48℃逆转录60min，94℃预变性2min。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45个循环后，68℃终延伸10min。对RT?PCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。
1.5 克隆质粒的构建
根据TA克隆原理[3]将TSHR膜外区片段插入pMD18?T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropin receptor ectodominant, ETSHR)片段3μL(约75ng DNA)，pMD18?T克隆载体1μL(约50ng DNA)，T4 DNA连接酶0.5μL，10×连接酶缓冲液5μL，加去离子水至10μL，至PCR仪上16℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个白色菌落，放入10mL LB培养液中，37℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。
1.6 真核表达载体的构建及鉴定
将上一步提纯的pMD? ETSHR重组质粒双酶切后，定向插入pcDNA3.1(+)质粒。反应体系为pMD? ETSHR重组质粒5μL，10×K Buffer 2μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。将酶切体系37℃过夜，65℃ 15min使灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入真核表达载体pcDNA3.1(+)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，酶切电泳分析，并送上海华诺生物科技公司鉴定。
2 结 果
2.1 RT?PCR产物的鉴定
电泳后发现，在Mark标记约1500bp处存在单一条带，特异性好，无其他扩增产物出现(图1)。
2.2 克隆质粒的电泳结果
酶切电泳结果呈现分子量大小约为2690bp和1245bp的两条清晰片段，证实该质粒中存在目的片段(图2)。
2.3 真核表达载体的酶切鉴定结果
酶切电泳后，出现分子量约5420bp和1245bp的两条特异性DNA片段，其中的小片段与PCR产物一致，表明获得正确克隆(图2)。
2.4 测序结果
克隆片段为1245bp的ETSHR编码区，与已发表的序列完全一致[2]，证实有包括起始密码子和kozak序列的完整ETSHR正确插入pcDNA3.1(+)质粒中。
3 讨 论
Nagayama于1989年利用G蛋白耦联受体家族中各受体间具有相似的结构和功能的特点，首先分离出了完整的人TSHR cDNA克隆。主要存在于甲状腺细胞膜上的TSHR蛋白含量较少，且结构不稳定，建立TSHR体外表达系统成为解决问题的关键。原核重组蛋白缺乏正常空间结构和糖基化，很快被真核表达系统所取代。TSHR体外表达系统不仅被用于TSHR结构和功能的研究，还被广泛用于Graves病动物模型的研究。TSHR膜外区的418个氨基酸残基是与TSH和TRAb结合的重要部位，因而国外学者用体外重组得到的TSHR膜外区纯化蛋白，可成功诱导甲亢动物模型[4]。 在国内，有提及原核表达载体的构建[5]，而涉及TSHR体外真核表达系统的研究较少，仅有一篇报道从国外惠赠载体中得到TSHR基因片段，重新构建了真核表达载体[6]。本研究是从人甲状腺组织中提取RNA，通过逆转录获得人TSHR膜外区 cDNA，构建了TSHR膜外区真核表达载体。人TSHR膜外区基因长度为1254bp，加之两端多克隆位点，pcDNA3.1(+)载体的T7通用引物之间大约有1500bp，而通常一个测序反应长度为500bp，正反向测序后，仍无法获得中段约300bp的序列编码。因此，我们采用了引物步查法(primer walking)，以T7通用引物测序结果为模板，设计合成一条 walking primer(5′?AAATTACAGACAACCCTTAC?3′)，将待测目的片段测通。这样使得测序结果准确无误，保证了pcDNA?ETSHR的正确表达。本试验在目的片段的上游加入了kozak序列(上游引物中黑体字部分)。该序列与翻译起始效率密切相关[7]，其-3位的A和+4位的G可显著促进AUG的识别效率，为下一步在哺乳动物细胞中的表达提供了有力工具。
【文献】
/[1/]Brown RS. Minireview: developmental regulation of thyrotropin receptor gene expression in the fetal and newborn thyroid /[J/]. Endocrinology, 2004, 145(9):4058?4061.
/[2/]Micheline M, Hugues L, Michel A, et al. Cloning, sequencing and expression of human TSH receptor /[J/]. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 166(1):394?403.
/[3/]萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南 /[M/]. 第 3 版. 北京：北京出版社, 2002:960?961.
/[4/]Gattadahalli S. Animal models of Graves? hyperthyroidism /[J/]. Autoimmunity, 2003, 36(6?7):381?387.
/[5/]吴晓燕，雒文田，徐利,等. 人促甲状腺激素受体胞外段的体外重组蛋白高效表达及其与构象功能的关系 /[J/]. 西安大学学报(医学版), 2003, 24(1):181?184.
/[6/]詹升华，张徽，刘纯. pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS?7细胞中的表达 /[J/]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(4):390?393.
/[7/]Susan R, Jessica A, Tiffany H, et al. Unanticipated antigens: translation initiation at CUG with leucine /[J/]. Plos Boil, 2004, 2 (11):366?367.
